不同溫度下金屬螯合劑對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)曲線的影響（一）
摘要
鰻弧菌(Vibrio anguillarum) 是一種水產(chǎn)動(dòng)物的重要致病菌，鰻弧菌分泌的胞外蛋白酶是該菌的致病因子之一。研究了環(huán)境因子對(duì)鰻弧菌W-1生長(zhǎng)及胞外蛋白酶表達(dá)的影響。結(jié)果表明,鰻弧菌的最適生長(zhǎng)溫度為28°C，菌體生長(zhǎng)量在21 h達(dá)到最高，胞外蛋白酶的活力在24 h最高。在37 °C培養(yǎng)時(shí)，菌體生長(zhǎng)和酶活力顯著降低；添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等碳源物質(zhì)均能顯著促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，但對(duì)于胞外蛋白酶表達(dá)有明顯抑制作用；1 mmol/L EGTA對(duì)菌體的生長(zhǎng)和胞外蛋白酶表達(dá)沒(méi)有明顯影響,而1 mmol/L的EDTA強(qiáng)烈抑制鰻弧菌的生長(zhǎng)及其胞外蛋白酶的表達(dá)。添加不同濃度的氨芐青霉素對(duì)菌體的生長(zhǎng)及其胞外蛋白酶表達(dá)有明顯的抑制作用。
鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是水產(chǎn)動(dòng)物的一種重要的致病菌，能引起世界范圍內(nèi)的淡水、海水魚(yú)類及其他動(dòng)物發(fā)生弧菌病，常給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。已發(fā)現(xiàn)鰻弧菌毒力因子有質(zhì)粒編碼的鐵吸收系統(tǒng)、細(xì)胞外溶血毒素、細(xì)菌鞭毛蛋白等。胞外蛋白酶也是鰻弧菌的一種重要的致病因子，Inamura等從一株致病性O(shè)1血清型的鰻弧菌PT81049胞外產(chǎn)物分離純化了一種金屬蛋白酶，SDS-PAGE電泳分析酶的分子質(zhì)量為36 u，該蛋白酶腹腔注射金魚(yú)和小鼠的LD50分別為1.7 μg/g和1.6 μg/g，Milton從鰻弧菌NB10克隆了金屬蛋白酶基因，編碼611個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈，完整蛋白的分子質(zhì)量為66.7 u。作者從山東沿海養(yǎng)魚(yú)場(chǎng)發(fā)病魚(yú)分離的致病性鰻弧菌W-1胞外產(chǎn)物中分離純化了1種胞外蛋白酶，對(duì)酶的理化性質(zhì)研究表明，該酶是一種金屬蛋白酶，純化的酶注射魚(yú)后能引起魚(yú)的組織損傷和死亡，該酶由611個(gè)氨基酸殘基組成，預(yù)測(cè)酶的活力中心氨基酸組成與霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌等的酶活力中心相似。已知病原菌的生長(zhǎng)及致病性跟其所處的環(huán)境密切相關(guān)，其毒力因子的表達(dá)受體內(nèi)外各種環(huán)境因子的影響，作者研究了在體外培養(yǎng)條件下，各種環(huán)境因子對(duì)鰻弧菌W1生長(zhǎng)及胞外蛋白酶表達(dá)的影響。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)菌株
致病性鰻弧菌W-1分離自山東省萊州灣海區(qū)發(fā)病的花鱸(Lateolabrax japanicus)，經(jīng)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化及Biolog系統(tǒng)鑒定為鰻弧菌(Vibrio anguillarum)。
1.2 菌體培養(yǎng)及胞外產(chǎn)物的獲得
鰻弧菌的培養(yǎng)采用2216E海水液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28°C，振蕩頻率為 180 r/min。培養(yǎng)物于4 °C 10 000 r/min離心 10 min，收集上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾去除殘余菌體,即得胞外產(chǎn)物。
1.3 菌體濃度、胞外產(chǎn)物蛋白含量及蛋白酶活力的測(cè)定
菌體濃度測(cè)定：鰻弧菌培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋后，于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(A)。
蛋白質(zhì)含量測(cè)定按Bradford方法進(jìn)行，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。
蛋白酶活力測(cè)定：參照Inamura方法，以偶氮酪蛋白為底物。在規(guī)定的條件下A值每增加0.001被定義為1個(gè)酶活力單位(U)。
1.4 培養(yǎng)方法
1.4.1 溫度對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)和蛋白酶表達(dá)的影響
菌體接種于2216E海水培養(yǎng)基，分別在15,28,37 °C條件下培養(yǎng)，振蕩頻率180 r/min，不同時(shí)間取樣，在600 nm波長(zhǎng)測(cè)菌體濃度，并測(cè)定蛋白酶活力。
1.4.2 碳源物質(zhì)對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)和蛋白酶表達(dá)的影響
2216E海水培養(yǎng)基中添加1%不同的碳源物質(zhì)(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖)，在28°C培養(yǎng)，不同時(shí)間取樣，在600 nm波長(zhǎng)測(cè)菌體濃度，并測(cè)定蛋白酶活力。另外，在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖(0.1%,0.5%,1%,2%)，用相同的方法測(cè)菌體濃度和酶活力。
1.4.3 抗生素對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)和蛋白酶表達(dá)的影響
在培養(yǎng)基中添加10,50,100 mg/L氨芐青霉素，在28°C培養(yǎng)，不同時(shí)間取樣，在600 nm波長(zhǎng)測(cè)菌體濃度，并測(cè)定蛋白酶活力。
1.4.4 EDTA 和 EGTA對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)和蛋白酶表達(dá)的影響
培養(yǎng)基中分別添加1 mmol/L的EDTA和 EGTA，在28°C培養(yǎng)，不同時(shí)間取樣，在600 nm波長(zhǎng)測(cè)菌體濃度，并測(cè)定蛋白酶活力。
2 結(jié)果
2.1 溫度對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)及胞外蛋白酶表達(dá)的影響
在28 °C條件下培養(yǎng)，菌體生長(zhǎng)和蛋白酶活力最好，從6~24 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在24 h時(shí)菌濃度達(dá)到最大；同步檢測(cè)了鰻弧菌分泌的胞外蛋白酶的活力，蛋白酶分泌與菌體生長(zhǎng)基本同步，活性隨著菌體的生長(zhǎng)逐漸升高,并在24 h達(dá)最大分泌量, 約36 h后緩慢下降（圖1）。15 °C條件時(shí)菌體生長(zhǎng)和酶活力都有一定降低，但差異不顯著（P>0.05），在37 °C條件下，菌體的生長(zhǎng)和胞外蛋白酶的表達(dá)均受到顯著的抑制（P<0.05）。
圖1 溫度對(duì)鰻弧菌W-1菌體生長(zhǎng)及胞外蛋白酶表達(dá)的影響
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