撒壩豬耳緣組織成纖維細胞系生長曲線、生物污染檢測結(jié)果——結(jié)果與分析、討論
2結(jié)果與分析
2.1撒壩豬成纖維細胞形態(tài)學觀察
組織塊培養(yǎng)5 d左右，成纖維細胞和少量類上皮細胞從組織塊周圍移出生長。隨著培養(yǎng)時間延長，大量成纖維細胞從組織塊周圍遷出并迅速增殖，成纖維細胞呈典型的長梭形。當細胞長至培養(yǎng)瓶(皿)底壁80%左右時，進行消化并傳代培養(yǎng)。細胞傳代后，生長加快，3～4 d細胞即可長滿瓶底而再次傳代。原代細胞及傳代后細胞的培養(yǎng)結(jié)果見圖1。
圖1撒壩豬成纖維細胞A：原代細胞(20 X)B：第5代細胞(20X)
2.2撒壩豬耳緣成纖維細胞凍存前及復蘇后細胞活率
撒壩豬耳緣組織成纖維細胞凍存前活率為94.16%，復蘇后活率為91.12%，細胞在凍存前和復蘇后都有較高的存活率，達到90%以上，表明細胞在生長時健康狀況良好，培養(yǎng)條件適宜。另外，凍存對其存活率影響不大。
2.3撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析
撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析結(jié)果如圖2所示：細胞與細胞之間排列疏松，無緊密連接和橋粒，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細胞器，胞核呈長梭形，常染色質(zhì)較為豐富。圖2A黃色箭頭所示為表皮層和真皮層的皮膚類細胞，為橢圓形。圖2A、2B紅色箭頭所示為位于基底層的成纖維細胞，為長梭型。
圖2撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析(黃色箭頭所示皮膚類細胞，紅色箭頭所示為成纖維細胞)
2.4撒壩豬成纖維細胞生長的動態(tài)觀察
每天計數(shù)結(jié)果取平均值，繪制撒壩豬成纖維細胞生長曲線呈“S”型(圖3)，細胞有約3d的緩慢生長期。此后進入指數(shù)生長期，第7天細胞數(shù)達最大。然后細胞生長進入平頂期，此時由于細胞密度增大，細胞生長受接觸抑制的影響，細胞開始衰老凋亡。
圖3撒壩豬成纖維細胞的生長曲線
2.5撒壩豬成纖維細胞核型分析
參照Levan[7]等的標準，第3代細胞核型取100個分裂相進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，撒壩豬染色體中正常二倍體染色體(2n=38)所占比例為92.56%。說明所培養(yǎng)的細胞遺傳性能穩(wěn)定，該細胞系為穩(wěn)定的二倍體細胞系。
圖4撒壩豬核型圖(母)(1000x)
2.6撒壩豬成纖維細胞系微生物污染檢測結(jié)果
2.6.1細菌、真菌污染檢測結(jié)果
接種細胞的液體培養(yǎng)基和陰性對照一樣，沒有混濁，而陽性對照表現(xiàn)有明顯微生物生長。
2.6.2病毒檢測結(jié)果
紅細胞吸附實驗結(jié)果為陰性。日常相差顯微鏡觀察，未見有病毒造成的細胞損傷現(xiàn)象。
2.6.3支原體檢測結(jié)果
實驗采用Hoechst 33342 DNA熒光染色法，未檢查到撒壩豬成纖維細胞被支原體污染。實驗組細胞經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，僅細胞核顯色，細胞表面及細胞周圍干凈、清晰，無熒光小點。如圖5 A所示。陽性對照組經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，可見細胞核與細胞膜及其周圍均可見散在的藍色熒光顆粒所圖5 B所示。證明我實驗室建立的撒壩豬成纖維細胞系支原體檢測呈陰性。
圖5撒壩豬成纖維細胞支原體檢測
3討論
據(jù)張利娟等報道，豬的染色體數(shù)目為2n=38。我們的實驗結(jié)果表明撒壩豬的染色體數(shù)目為2n=38，與上述結(jié)論一致。撒壩豬成纖維細胞體外培養(yǎng)中，隨著傳代次數(shù)的增加，生長速度會變慢。此外，細胞的二倍體染色體數(shù)目正常的比例呈逐步下降的趨勢，細胞遺傳穩(wěn)定性有所改變?？赡苁怯捎诩毎旧矶肆Ｃ搁L度的縮短或者體外培養(yǎng)環(huán)境對細胞的DNA造成的損傷。而本實驗要求培養(yǎng)的細胞始終維持二倍體生物學性狀，保持與體內(nèi)細胞相似性較大，因此不能傳代太多，傳2～3代細胞不用于實驗就立即低溫凍存。對原代細胞以及復蘇后細胞中染色體眾數(shù)進行檢測，2n=38的占90%以上，染色體沒有異常表現(xiàn)，說明該細胞系為穩(wěn)定二倍體細胞系。
核型制備過程中，固定和滴片是核型分散成功的保證，適當?shù)牡纹叨纫彩侨旧w分散良好的重要條件。撒壩豬成纖維細胞核型制備時，用0.25μg/mL終濃度的秋水仙胺處理細胞2.5 h，低滲40 min，1.5 m滴片，能夠得到分散度好、數(shù)量多的細胞中期染色體。撒壩豬染色體長度的測定計算中，實驗對多個中期染色體分裂相進行了觀察、分析、比對。實驗結(jié)果表明，撒壩豬的染色體2n=38，與其它豬的染色體相似。
本研究從撒壩豬耳緣組織中分離、培養(yǎng)并建立了成纖維細胞系。通過形態(tài)學觀察結(jié)果看，細胞為長梭形，絕大多數(shù)是成纖維細胞，其中含有少量其他類型的細胞，如上皮細胞。由于上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶耐受性不同。因此，利用此差別，通過幾次傳代后，就可得到純化的成纖維細胞。
低溫保存技術(shù)是生物科學的一門分支學科，是指將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定冷凍速率(或不同溫度梯度應(yīng)用不同的冷凍速率，并且有一定的保持時間)降至零下某一溫度(一般是低于-70℃的超低溫)，此溫度能夠維持生物樣本活性暫停，進而可以長期保存。細胞保存過程中，需要盡可能降低細胞內(nèi)冰晶的形成，從而保持解凍后細胞活性、黏附能力及代謝活性。本試驗采用10%DMSO加培養(yǎng)液來凍存細胞，凍存前細胞活率為94.16%，復蘇后的細胞活率91.12%，細胞復蘇后10～15 h可見細胞貼壁；復蘇后第2天更換培養(yǎng)液，2～3 d長滿培養(yǎng)瓶。說明凍存的各項條件對細胞損傷不大，撒壩豬成纖維細胞可在液氮凍存，解凍后細胞可繼續(xù)傳代培養(yǎng)，活率與凍存前相比相差不大。可以用該法保存撒壩豬這種優(yōu)良的動物遺傳資源。
綜上所述，本研究建立的撒壩豬耳緣組織成纖維細胞系增殖快，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定。該細胞系的建立，使撒壩豬這一國家重要遺傳資源在細胞水平上得以保存下來，并為相關(guān)遺傳學研究提供了有效的理論依據(jù)和理想的生物材料。同時對于開展其他動物成纖維細胞系的建立也有一定的理論和技術(shù)指導意義。
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