基于生長速率法評估植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌抑制效果（一）
摘要
摘要：采用生長速率法測定植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌菌絲生長的影響，并對抑菌活性物質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該菌的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌菌絲的生長有抑制作用。發(fā)酵液中的活性物質(zhì)有較好的熱穩(wěn)定性，在pH6.0時(shí)抑菌效果較好，對酸性蛋白酶敏感，對中性蛋白酶不敏感，常溫下10d的穩(wěn)定性較好。通過調(diào)節(jié)pH、酶處理和加熱處理實(shí)驗(yàn)，說明其抑菌活性物質(zhì)不是乳酸，蛋白質(zhì)類物質(zhì)起了一定的抑菌作用，但其抑菌現(xiàn)象可能是與其他物質(zhì)共同作用的結(jié)果。
引言
疫霉菌是疫霉屬(Phytophthora)真菌的統(tǒng)稱，隸屬鞭毛菌亞門卵菌綱霜霉目腐霉科疫霉菌。疫霉菌大多存活于土壤，潛育期短，傳播速度快，侵染力強(qiáng)，對植物破壞性大。病菌侵入寄主植物后在很短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的孢子囊并釋放游動孢子，成為再侵染源，使該病害難以控制，經(jīng)常給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。
目前對植物卵菌病害依靠化學(xué)防治，常用殺菌劑如瑞毒霉、殺毒礬、甲霜靈等藥物。這些藥劑價(jià)格昂貴，長期大量施用對人和環(huán)境造成極大危害，因此開發(fā)環(huán)保、高效的生物農(nóng)藥具有重要意義。
利用有益微生物制約有害微生物，是開發(fā)和利用微生物資源的重要研究領(lǐng)域之一，在植物病害防治中最具潛力，應(yīng)用前景最為廣闊。
目前已有不少以活體微生物或其代謝產(chǎn)物控制致病疫霉菌及其危害為目的的研究。Fachouri等從P.fluorescens菌株G308中分離出一種新的抗生素N-mercapto-4-formylcar-bostyril(Cbs)，可在體外抑制馬鈴薯晚疫病的孢子萌發(fā)及菌絲體生長；王艷紅等從土壤中篩選出一株放線菌WL70，其代謝產(chǎn)物可抑制番茄早疫病菌。這些研究表明，從微生物代謝產(chǎn)物中分離抗植物致病菌的生物活性成分用于生物農(nóng)藥開發(fā)是很有可能的。
乳酸菌是能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。目前有關(guān)乳酸菌抑菌的報(bào)道甚多，但這些報(bào)道多集中于對細(xì)菌的抑制作用，其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要有有機(jī)酸、過氧化氫以及細(xì)菌素等。
近年來的研究表明，某些乳酸桿菌可抑制霉菌的生長和產(chǎn)毒。
唐雨蕊等從牛糞中分離出一株乳酸桿菌BN3，它能明顯地抑制黃曲霉的生長，并且對黃曲霉的孢子萌發(fā)有抑制作用。本文對植物乳桿菌Bx6-2發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物的抑制疫霉作用及理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，為乳酸菌在生物農(nóng)藥方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1材料及方法
1.1菌株
植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Bx6-2由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從酸馬奶中分離得到。甜瓜疫霉菌(Phytophthora.drechsleri Tucker)由天津市植物保護(hù)研究所提供。
1.2培養(yǎng)基
V8培養(yǎng)基：V8汁20mL，瓊脂1.5 g，CaCO?0.3 g，蒸餾水80 mL。
MRS培養(yǎng)基：蛋白胨胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，吐溫80 1 mL，檸檬酸三銨2 g，K?HPO?2 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，MgSO?·7H?O 0.1 g，MnSO?·4H?O 0.05 g，蒸餾水1000mL，pH 6.5。
燕麥培養(yǎng)基：50 g燕麥片加到1000 mL蒸餾水中，在60°C恒溫水浴鍋中加熱1h，經(jīng)4層紗布過濾去渣，加蒸餾水稀釋到1000 mL，再加入瓊脂18 g。
PDA培養(yǎng)基：200 g去皮土豆切塊，加入1000 mL蒸餾水，煮沸30 min后2層紗布過濾去渣，加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g，稀釋到1000 mL。
上述培養(yǎng)基均在121°C滅菌20 min。
1.3植物乳桿菌培養(yǎng)液的制備
將保存的植物乳桿菌Bx6-2接種到新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48h，按1%接種量接種到新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)48h。將其發(fā)酵液以3000 r/min離心20 min，取上清液備用。
1.4不同培養(yǎng)基對甜瓜疫霉菌
將甜瓜疫霉菌接種于V8培養(yǎng)基平板上，25°C培養(yǎng)4 d。用打孔器在菌落邊緣處打取直徑5mm的菌塊，將菌塊分別放在燕麥培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、V8培養(yǎng)基平板的中央，25°C培養(yǎng)4 d后測量各菌落直徑，比較不同培養(yǎng)基對甜瓜疫霉菌菌絲生長的影響，確定其生長的最適培養(yǎng)基。
1.5植物乳桿菌發(fā)酵液對菌絲生長的抑制作用
植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液對甜瓜疫霉菌抑菌活性的測定參照黃雄英等采用的生長速率法，并對該方法進(jìn)行了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。將植物乳桿菌Bx6-2的上清液以體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、2%、4%和8%加入到20 mL的V8培養(yǎng)基中，再分別倒入90 mm直徑的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板；以不加發(fā)酵液的培養(yǎng)基為對照。用打孔器在菌落邊緣處打取直徑5mm的菌塊，放置在平板中央，25°C培養(yǎng)4 d，測量菌落直徑(d)，按公式(1)計(jì)算抑菌率。
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