基于微生物生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)探究肺炎克雷伯菌菌株毒力與碳青霉烯類(lèi)耐藥性的關(guān)系（三）
2.4 CR-HVKP菌株的基因組特征和藥敏試驗(yàn)結(jié)果
CR-HVKP菌株分離自重癥監(jiān)護(hù)病房的一例41歲急性白血病女性患者，同時(shí)患有肺炎和肝包蟲(chóng)病，并發(fā)感染性休克。PCR未檢測(cè)到該株CR-HVKP菌株攜帶碳青霉烯類(lèi)基因，全基因組測(cè)序結(jié)果顯示其攜帶blaSHV-145、blaTEM-1、blaCTX-M-3、fosA6、oqxA5、oqxB26和aac（3）-IId耐藥基因，MLST型別為412，OmpK35和OmpK36基因中存在IS10L插入序列，攜帶rmpA、iutA、entB、mrkD和fimH毒力基因，莢膜抗原分型為K57，具有高黏表型。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該株CR-HVKP對(duì)頭孢類(lèi)、酶抑制劑、厄他培南和美羅培南耐藥，對(duì)亞胺培南中介，對(duì)氟喹諾酮類(lèi)敏感。由于患者存在免疫缺陷及多重感染，故采用頭孢哌酮舒巴坦、利奈唑胺、莫西沙星、亞胺培南單用或聯(lián)用進(jìn)行抗感染治療，同時(shí)接受長(zhǎng)春瑞濱和順鉑化療。患者最終因本次感染預(yù)后不佳要求出院。
2.5 CR-HVKP菌株的毒力鑒定結(jié)果
生物膜形成試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不攜帶碳青霉烯酶基因CRKP、CSKP、攜帶碳青霉烯酶基因CRKP、CS-HVKP、CR-HVKP、標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700603的吸光度值依次為0.480、0.297、0.628、0.500、0.767、0.292，其中CR-HVKP生物膜形成能力最強(qiáng)，其后依次為攜帶碳青霉烯酶基因CRKP（強(qiáng)）、CS-HVKP（中等）、不攜帶碳青霉烯酶基因CRKP（中等）、CSKP（弱）和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700603（弱）。血清抗性試驗(yàn)結(jié)果顯示，CR-HVKP和CS-HVKP為高抵抗（6級(jí)），攜帶碳青霉烯酶基因CRKP為中等抵抗（4級(jí)），其余菌株對(duì)血清無(wú)抵抗（2級(jí)），見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，CR-HVKP菌株的毒力較CRKP、CSKP和CS-HVKP菌株均有明顯提高。
圖1六株肺炎克雷伯菌血清抗性試驗(yàn)結(jié)果
CR-HVKP攜帶5個(gè)毒力基因（entB、rmpA、mrkD、iutA和fimH），呈現(xiàn)高黏表型，未檢測(cè)到碳青霉烯酶基因；不攜帶碳青霉烯酶基因CRKP攜帶3個(gè)毒力基因（entB、mrkD和fimH）；攜帶碳青霉烯酶基因CRKP攜帶blaKPC-2基因和3個(gè)毒力基因（entB、mrkD和fimH）；CS-HVKP攜帶7個(gè)毒力基因（entB、mrkD、fimH、iutA、rmpA、ybtS和aerobictin），呈現(xiàn)高黏表型；CSKP攜帶3個(gè)毒力基因（entB、mrkD和fimH）.CR-HVKP：碳青霉烯類(lèi)耐藥高毒力肺炎克雷伯菌；CRKP：碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌；CS-HVKP：碳青霉烯類(lèi)敏感高毒力肺炎克雷伯菌；CSKP：碳青霉烯類(lèi)敏感肺炎克雷伯菌；entB：鐵載體腸桿菌素；rmpA：黏液樣表型A調(diào)節(jié)基因；mrkD：黏附因子3型菌毛基因；iutA：鐵載體氣桿菌素；fimH：黏附因子1型菌毛基因；ybtS：鐵載體耶爾森桿菌素；aerobictin：鐵載體需氧菌素.
3討論
肺炎克雷伯菌引起的血液感染病死率高、患者住院時(shí)間延長(zhǎng)和醫(yī)療費(fèi)用增加。全球肺炎克雷伯菌的耐藥性和毒力水平升高，需要尋找新的治療方案。本研究對(duì)四川大學(xué)華西醫(yī)院192例血液感染的肺炎克雷伯菌進(jìn)行分析，探討肺炎克雷伯菌毒力因子與碳青霉烯類(lèi)耐藥性之間的關(guān)系。
本文資料顯示，96株CRKP中攜帶blaKPC-2占83.7%，攜帶blaNDM-5占12.0%，同時(shí)攜帶blaKPC和blaNDM占4.3%，與Wang等的研究結(jié)果基本一致。
肺炎克雷伯菌的耐藥性已成為公認(rèn)的治療難題，而高毒力菌株的存在則會(huì)使得治療更加困難。截至目前，與肺炎克雷伯菌毒力相關(guān)的因素主要有莢膜、鐵載體、脂多糖、毒力質(zhì)粒pLVPK和KPHP1208致病島等。本研究對(duì)肺炎克雷伯菌毒力相關(guān)的菌毛（mrkD、fimH）、鐵載體（entB、aerobictin、iutA、ybtS、Kfu）、尿囊素代謝（allS）和莢膜（K1、K2、K5、K20、K54、K57、rmpA、magA）進(jìn)行研究。其中，菌毛與細(xì)菌黏附有關(guān)；鐵載體相關(guān)蛋白如Kfu蛋白可通過(guò)螯合作用促進(jìn)游離鐵吸收，并促進(jìn)Kfu基因編碼產(chǎn)物的產(chǎn)生，提高細(xì)菌的生長(zhǎng)和定植能力；在需氧或厭氧條件下，allS基因負(fù)責(zé)尿囊素的厭氧同化，作為碳、氮和能量的唯一來(lái)源，小鼠致死試驗(yàn)顯示allS基因與菌株的毒力顯著相關(guān)；莢膜可以保護(hù)細(xì)菌不被吞噬，通過(guò)阻止抗菌肽和補(bǔ)體在細(xì)菌表面的沉積，避免抗菌肽和補(bǔ)體的殺菌作用。本文資料顯示，CRKP和CSKP攜帶mrkD和fimH的比例均超過(guò)90%，表明肺炎克雷伯菌普遍產(chǎn)生Ⅰ型和Ⅲ型菌毛。但是，與CRKP比較，CSKP中aerobictin、iutA、ybtS和Kfu的陽(yáng)性率明顯升高，提示CSKP比CRKP具有更強(qiáng)的存活、定植和鐵攝取能力；CSKP中allS基因和莢膜相關(guān)基因的陽(yáng)性率也均高于CRKP，且與高毒力相關(guān)的莢膜血清型K1和K2在CSKP中更為常見(jiàn)，檢出率分別為20.8%和13.5%。
此外，既往研究顯示，與侵襲性感染密切相關(guān)的allS和Kfu僅存在于莢膜血清型K1的肺炎克雷伯菌中；而本研究在K57 CRKP和K1 CSKP分離株中均檢出allS和Kfu基因，推測(cè)莢膜血清型K57菌株亦可能與侵襲性感染高度相關(guān)。此外，17.7%CSKP攜帶10種毒力基因，13.5%CSKP攜帶7種毒力基因，但大多數(shù)CRKP（87.5%）只攜帶3種毒力基因。上述結(jié)果提示，CRKP雖能抵抗抗菌藥物，但其捕獲鐵離子和逃避宿主免疫攻擊的能力不如CSKP；CRKP攜帶的毒力基因數(shù)和種類(lèi)少于CSKP，莢膜抗原（K1和K2）主要存在于CSKP細(xì)菌中，其原因可能是基于能量平衡規(guī)律，在獲得耐藥基因的同時(shí)，毒力基因相對(duì)減少。
目前關(guān)于HVKP的定義仍存在爭(zhēng)議。第一株HVKP分離自化膿性肝膿腫患者，該菌株同時(shí)具有高黏表型。此后，高黏表型被廣泛用作HVKP的標(biāo)志，即拉絲實(shí)驗(yàn)結(jié)果在5 mm及以上。但是，Russo等評(píng)估了拉絲實(shí)驗(yàn)、毒力因子、莢膜分型等在HVKP檢測(cè)中的作用，發(fā)現(xiàn)拉絲實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株不一定具有黏液樣表型，具有高黏液特征的菌株拉絲實(shí)驗(yàn)可呈陰性；盡管拉絲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HVKP存在諸多問(wèn)題，但其準(zhǔn)確率可達(dá)90%；同時(shí)發(fā)現(xiàn)評(píng)價(jià)毒力準(zhǔn)確率最高的毒力基因?yàn)閕roB、iutA、rmpA和rmpA2，陽(yáng)性率均超過(guò)95%。Yang等也發(fā)現(xiàn)HVKP的拉絲實(shí)驗(yàn)未呈陽(yáng)性，通過(guò)嗜中性粒細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)和大蠟螟感染模型證實(shí)攜帶rmpA/rmpA2、沙門(mén)菌素相關(guān)基因iroBCDN和需氧菌素鐵攝入系統(tǒng)（iucABCD）的肺炎克雷伯菌具有較強(qiáng)的毒力。從臨床表現(xiàn)來(lái)看，HVKP多引起患者轉(zhuǎn)移性感染，如血流感染、化膿性肝膿腫、肺炎、膽道感染、軟組織疾病和自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎。納入本次研究的肺炎克雷伯菌均分離自血流感染患者，結(jié)合菌株的毒力特性（攜帶rmpA和iutA基因并具有高黏表型），本研究將符合這類(lèi)特征的肺炎克雷伯菌定義為HVKP。本文資料中，共檢出1株CR-HVKP和36株CS-HVKP。
本文資料中這株CR-HVKP菌株分離自重癥監(jiān)護(hù)病房的一例41歲女性血液腫瘤患者，雖然菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性較好，但住院期間使用頭孢哌酮舒巴坦、利奈唑胺、莫西沙星和亞胺培南治療后預(yù)后仍不理想。經(jīng)檢測(cè)，該株CR-HVKP不攜帶碳青霉烯酶基因，具有高黏表型，莢膜分型為K57，攜帶多種毒力基因（rmpA、iutA、entB、mrkD、fim），表現(xiàn)出較強(qiáng)的血清抵抗性和生物膜形成能力。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CR-HVKP菌株攜帶blaSHV-145、blaTEM-1和blaCTX-M-3基因，OmpK35和OmpK36存在變異，MLST型別為412，推測(cè)該菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的機(jī)制是OmpK35/OmpK36異常伴隨ESBL的產(chǎn)生。Zhang等報(bào)道了一株MLST型別為65的CR-HVKP菌株，其攜帶blaCTX-3、blaDHA-1、blaSHV-11和blaTEM-53基因，伴隨OmpK35/OmpK36表達(dá)減少，同時(shí)表達(dá)ESBL基因，為K2莢膜型，且攜帶rmpA、aerobactin和entB毒力基因，對(duì)除替加環(huán)素外的抗菌藥物耐藥；Li等也報(bào)道了MLST型別為11型的CR-HVKP伴隨OmpK35/OmpK36缺失。結(jié)合本文資料，推測(cè)OmpK35/OmpK36變異可能與HVKP的毒力相關(guān)，但有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
綜上所述，CRKP對(duì)抗菌藥物的耐藥率明顯高于CSKP，雖然其攜帶的毒力基因數(shù)和種類(lèi)均少于CSKP，但也出現(xiàn)了碳青霉烯類(lèi)耐藥且高毒力的新型MLST型肺炎克雷伯菌。提示臨床和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)關(guān)注這類(lèi)病原菌，并結(jié)合患者臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室提供的檢測(cè)結(jié)果盡早明確診斷，對(duì)患者提前進(jìn)行干預(yù)治療，以期改善患者預(yù)后。
數(shù)據(jù)說(shuō)明本研究提供的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)可在NCBI Sequence Read Archive（SRA）中獲得，檢索號(hào)為PRJNA786277
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