貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定及抑菌性能分析
浙江國(guó)際海運(yùn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋旅游學(xué)院朱亞珠和寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院夏率博，陳琳，劉洋，吳祖芳，翁佩芳從自然發(fā)酵海洋魚醬油中分離得到了一株具有多種蛋白酶活性與糖酶活性的貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株，為探究貝萊斯芽孢桿菌SW5的抑菌特性，研究了SW5菌株的生長(zhǎng)及生理生化特性，驗(yàn)證了SW5菌株發(fā)酵上清液對(duì)食品中多種常見病原菌的抑制能力；并利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定了其中的抑菌物質(zhì)。結(jié)果表明：菌株SW5在35℃、pH值5時(shí)生長(zhǎng)最快，對(duì)于亞胺培南、頭孢曲松等β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感。菌株SW5的發(fā)酵上清液具有明顯的抑菌活性，上清液經(jīng)過濃縮后抑菌效果顯著增強(qiáng)。TOF-MS分析表明，發(fā)酵上清液中含有的抑菌物質(zhì)為表面活性素、山茱萸苷A、氨基糖苷類抗生素慶大霉素與異帕米星、鏈霉菌素類抗生素達(dá)福普丁。研究結(jié)果以期為菌株SW5的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。
芽孢桿菌是廣泛存在于環(huán)境中的益生菌之一，在增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，提高免疫力和改善生產(chǎn)性能等方面具有良好的效果[1]。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)作為芽孢桿菌的一個(gè)新種，具有植物促生長(zhǎng)、生物防治、制備生物修復(fù)劑及產(chǎn)生多種酶和抗菌物質(zhì)等功能[2]，其中的抗氧化性與具有的載體物質(zhì)胞外多糖[3]和活性肽[4]有關(guān)，可作為一種理想的微生物源抗氧化劑。全基因圖譜分析顯示[5-6]，B.velezensis基因組中含有srfAA、srfAB、ituC、bmyB、bioA及fen等多種脂肽類抗生素相關(guān)基因，且含有非核糖體多肽合成酶(NRPSs)基因簇，可指導(dǎo)合成多種常見的、具有廣譜抑真菌活性的脂肽，如表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、芬薺素(fengycin)等，這類脂肽類物質(zhì)能夠?qū)φ婢愔参锊≡w產(chǎn)生明顯的拮抗作用[7-8]。B.velezensis對(duì)白菜黑斑病菌[9]、番茄灰霉病菌[10]、小麥赤霉病菌及小麥全蝕病菌[11]等多種植物病原菌具有拮抗作用，因此在農(nóng)業(yè)上有作為生物抑制劑的潛能[12]。這些特性在食品行業(yè)中也具有一定的應(yīng)用潛力，但鮮有報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)前期研究中，從自然發(fā)酵海洋魚醬油樣品中分離得到了一株貝萊斯芽孢桿菌SW5(Bacillus velezensis SW5，以下簡(jiǎn)稱SW5)菌株，具有較強(qiáng)的蛋白酶活性和較好的水解海洋魚類蛋白的特性[13]。本研究進(jìn)一步對(duì)菌株SW5的生長(zhǎng)特性、生理生化特性及抑菌性能進(jìn)行分析，并分離純化和初步鑒定其發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，為SW5菌株在海洋蛋白質(zhì)資源深度利用、食品保鮮與安全等方面的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
貝萊斯芽孢桿菌SW5及實(shí)驗(yàn)菌株(鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌)，寧波大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏。
HCl、NaOH等(分析純)及LB、TSB、NB培養(yǎng)基，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;LDZX-40BⅠ型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;5804R型高速大容量冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;QY-2102C型全溫振蕩培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1培養(yǎng)基配制
MOLP培養(yǎng)基[14](mg/L)：蛋白胨30 000、蔗糖20 000、酵母提取物7 000、KH2PO4 1 900、CuSO4 0.001、FeCl3·6H2O 0.005、Na2MoO4 0.004、KI 0.002、MnSO4·H2O 3.6、MgSO4 450、ZnSO4·7H2O 0.14、H3BO3 0.01、C6H8O7 10，pH值7.0。LB固體培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10、胰蛋白胨10、酵母提取物5、瓊脂15。
1.3.2不同環(huán)境因素對(duì)菌株SW5生長(zhǎng)影響的測(cè)定
在LB培養(yǎng)基中接種2%SW5菌株，30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)3 d，分別測(cè)定不同溫度(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50℃)、pH值(3、4、5、6、7、8、9、10、11)、NaCl質(zhì)量濃度(0、5、10、15、20、25、30 g/mL)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。細(xì)胞生物量的測(cè)定方法：分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處吸光度，根據(jù)吸光度大小判斷生長(zhǎng)狀態(tài)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。
1.3.3菌株SW5生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
將菌株SW5種子液(OD600約為1)，按2%接種量接種到含有50 mL LB培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，在不同時(shí)間取樣，測(cè)定其在600 nm處的吸光度，然后以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。
1.3.4菌株SW5的抗生素抗性測(cè)定
將SW5菌株按2%接種量接種于TSA平板上，在平板中央打孔，加入一定濃度的EUCAST推薦的抗生素，在37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量透明圈直徑，直徑越大說明其對(duì)抗生素越敏感。
1.3.5菌株SW5發(fā)酵上清液的抑菌特性測(cè)定
選取食品中常見的8種病原菌(鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌)為指示菌，取1 mL新鮮菌液加入100 mL的NB固體培養(yǎng)基中，迅速倒入培養(yǎng)皿中，作為指示菌平板。并在平板上用無(wú)菌打孔器打孔備用。取活化好的SW5菌株，按3%的接種量接種于MOLP培養(yǎng)基，在37℃、200 r/min的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。8 000 r/min離心10 min，得到發(fā)酵上清液。取50μL發(fā)酵上清液加入指示菌平板的孔中，37℃下培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑。
1.3.6濃縮發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定
在20 mL發(fā)酵上清液中加入10 mL的正丁醇，搖勻后離心，抽出有機(jī)相后再加入相同體積的正丁醇，重復(fù)抽提3次，得到30 mL有機(jī)相抽提液。將抽提液進(jìn)行冷凍干燥，完全凍干后再加入2 mL無(wú)菌水溶解，得到濃縮15倍的發(fā)酵上清液。按1.3.5節(jié)方法測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌活性。
1.3.7發(fā)酵液抑菌物質(zhì)鑒定
以濃縮后發(fā)酵上清液為原料，體積分?jǐn)?shù)10%甲醇為溶劑，采用UHPLC-Q Exactive系統(tǒng)，鑒別出其中的抑菌物質(zhì)[7]。色譜條件：色譜柱BEHC18(100 mm×2.1 mm，1.7μm)；流動(dòng)相A為水(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈-異丙醇(體積比1∶1)(含0.1%甲酸)；流速0.40 mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫40℃。原始數(shù)據(jù)用代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI(美國(guó)Waters Corporation)進(jìn)行搜庫(kù)鑒定，數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源為http:∥www.hmdb.ca。
2結(jié)果與分析
2.1貝萊斯芽孢桿菌SW5的菌落形態(tài)分析
將貝萊斯芽孢桿菌SW5接種在LB固體培養(yǎng)基上，觀察其菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)SW5菌株在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形或橢圓形，一般較大，顏色為不透明灰白色，表面有皺褶，菌落中心有凸起，該結(jié)果與鐘麗娟等[15]分離的貝萊斯芽孢桿菌菌落形態(tài)類似。
2.2菌株SW5的生長(zhǎng)曲線分析
貝萊斯芽孢桿菌SW5的生長(zhǎng)曲線如圖1。由圖1可知，接種貝萊斯芽孢桿菌SW5后，延遲期為0～2 h，此時(shí)菌株生長(zhǎng)緩慢；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為2～14 h，此時(shí)菌體數(shù)明顯增多，其中培養(yǎng)至第9 h時(shí)，其生長(zhǎng)速率達(dá)到最大；穩(wěn)定期為16～26 h，菌體數(shù)不再增加，26 h時(shí)菌體的OD600值達(dá)到最大；最后在26 h后進(jìn)入衰亡期，菌體數(shù)量開始下降。
圖1貝萊斯芽孢桿菌SW5的生長(zhǎng)曲線
2.3菌株SW5的生理生化特性分析
2.3.1不同環(huán)境因素對(duì)菌株SW5生長(zhǎng)的影響
菌株SW5在不同溫度下的細(xì)胞生長(zhǎng)情況如圖2。結(jié)果表明：菌株在16～50℃均可生長(zhǎng)，溫度大于16℃時(shí)，溫度升高生長(zhǎng)速度加快，最適生長(zhǎng)溫度為35℃。pH值對(duì)菌株SW5生長(zhǎng)的影響如圖3。從圖3可以看出，pH值為3時(shí)細(xì)胞不可生長(zhǎng)，pH值4～9時(shí)均可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH值為5。不同NaCl質(zhì)量濃度下的細(xì)胞生長(zhǎng)情況如圖4。結(jié)果表明：在質(zhì)量濃度0～20 g/100 mL均可生長(zhǎng)，0～5 g/100 mL時(shí)的生長(zhǎng)速度呈上升趨勢(shì)，5～20 g/100 mL時(shí)生長(zhǎng)速度呈下降趨勢(shì)。
2.3.2菌株SW5抗生素抗性結(jié)果分析
菌株SW5對(duì)抗生素抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5。
AMP：氨芐西林，GEN：慶大霉素，KAN：卡那霉素，STR：鏈霉素，NEO：新霉素，TET：四環(huán)霉素，ERY：紅霉素，CIP：環(huán)丙沙星，CLI：克林霉素，VAN：萬(wàn)古霉素，RIF：利福霉素，CHL：氯霉素，TRI：甲氧芐啶，LIN：利奈唑胺，QUI：達(dá)福普丁，PB：多黏菌素B，CTR：頭孢曲松，IMI：亞胺培南，CAZ：頭孢他啶。
SW5菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素，如頭孢曲松、亞胺培南，以及氯霉素表現(xiàn)得較為敏感；而對(duì)多粘菌素B與克林霉素則體現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性。張小波等[16]獲得了一株鴨源貝萊斯芽孢桿菌GZZY2019，藥敏實(shí)驗(yàn)顯示該菌對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等15種藥物敏感，對(duì)丁胺卡那、哌拉西林、四環(huán)素3種藥物中敏，對(duì)多粘菌素B、苯唑西林等6種藥物耐藥。表明貝萊斯芽孢菌株對(duì)多數(shù)抗生素表現(xiàn)為敏感，而對(duì)多粘菌素B等少數(shù)抗生素表現(xiàn)為耐藥，這種特性為其在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用創(chuàng)造了條件與基礎(chǔ)。
2.4菌株SW5的抑菌活性及抗菌成分分析
菌株SW5發(fā)酵上清液對(duì)幾種常見病原菌的抑菌活性如何？結(jié)果表明：菌株經(jīng)過MOLP培養(yǎng)基的發(fā)酵，其上清液對(duì)于福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出一定的抑制作用。發(fā)酵上清液濃縮15倍后，對(duì)于福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌的抑菌性增強(qiáng)，其中弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌的抑菌效果變化最為顯著；而對(duì)蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌來(lái)說，發(fā)酵液濃縮后抑菌性稍有減弱。整體來(lái)說，菌株SW5的發(fā)酵液對(duì)于福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌均具有較為顯著的抑菌效果，SW5菌株可作為今后潛在的益生菌應(yīng)用菌株[17]。
指示菌依次為1.福氏志賀氏菌，2.鼠傷寒沙門氏菌，3.枯草芽孢桿菌，4.蠟樣芽胞桿菌,5.奇異變形桿菌,6.金黃色葡萄球菌，7.弗氏檸檬酸桿菌，8.大腸埃希氏菌。
為進(jìn)一步探究SW5菌株MOLP培養(yǎng)基抗菌特性的原因，以濃縮后的發(fā)酵液樣品為研究對(duì)象，通過質(zhì)譜分析法檢測(cè)其抗菌成分，發(fā)酵液質(zhì)譜檢測(cè)的總離子色譜結(jié)果。該檢測(cè)條件下，峰形良好，分布相對(duì)均勻。
四極飛行時(shí)間質(zhì)譜分析并結(jié)合代謝組學(xué)軟件和搜庫(kù)鑒定等綜合分析表明：m/z 1 036.69處的吸收峰分子式為C53H93N7O13，對(duì)應(yīng)表面活性素；m/z 860.42處的吸收峰分子式為C21H43N5O7，對(duì)應(yīng)莫西霉素、大環(huán)內(nèi)脂類抗生素；m/z 655.31處的吸收峰分子式為C34H50N4O9S，為達(dá)福普汀，屬于鏈霉菌素類抗生素；m/z 557.27處的吸收峰分子式為C29H42O9，為山茱萸苷A；m/z 608.25處的吸收峰分子式為C22H43N5O12，為異帕米星，屬于氨基糖苷類抗生素。
菌株SW5發(fā)酵液的成分檢測(cè)表明：發(fā)酵液中共檢測(cè)到5種不同性質(zhì)的典型抗菌活性成分，印證了實(shí)驗(yàn)菌發(fā)酵上清液抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。細(xì)菌素是貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)抑菌物質(zhì)，張海林等[18]純化出了一種細(xì)菌素，分子質(zhì)量約為10 kDa，能夠抵抗蛋白酶K、胃蛋白酶等多種蛋白酶水解，且對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌均有較強(qiáng)的抑制能力。在常見細(xì)菌或放線菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)研究中已有較多報(bào)道，如在假單胞菌20#-5菌株[19]、海洋放線菌B5[20]、巨大芽孢桿菌L2[21]、枯草芽孢桿菌SB1[22]等菌株的代謝產(chǎn)物中找到了抑菌物質(zhì)，并對(duì)它們的抑菌效果進(jìn)行廣泛的探索。而作為一種具有特殊蛋白酶活性多樣性與較高蛋白酶活力的SW5菌株[23]，同時(shí)兼?zhèn)洚a(chǎn)生多種具有抗菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力，進(jìn)一步說明了貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株具有的復(fù)雜代謝體系及存在多種酶活性，從而賦予SW5菌株多重生物學(xué)性能。SW5菌株在食品工業(yè)的進(jìn)一步開發(fā)與實(shí)際應(yīng)用還有待進(jìn)一步的研究。
3、結(jié)論
貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)(12 h)，在多種培養(yǎng)基中均能以較快速度生長(zhǎng)，且在16～50℃、pH值4～9、NaCl質(zhì)量濃度為0～20g/100 mL可生長(zhǎng)。SW5菌株發(fā)酵上清液對(duì)福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，其發(fā)酵上清液中含有多種氨基糖苷類抗生素，如表面活性素、莫西霉素和異帕米星等，從而對(duì)多種病原菌產(chǎn)生抑制作用。
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