鼻氣管鳥桿菌生長曲線測定：光電比濁法VS平板菌落計數(shù)法
為了全面解析鼻氣管鳥桿菌（Ornithobacterium rhinotracheale，ORT）的增殖特性，本研究采用雙軌并行檢測策略：一方面通過分光光度計動態(tài)監(jiān)測培養(yǎng)液在600nm波長下的吸光度（OD600）變化，精確捕捉菌體密度波動；另一方面運用平板菌落計數(shù)法（colony-forming unit，cfu）定量分析活菌種群動態(tài)，構(gòu)建雙重生長曲線進行交叉驗證。實驗數(shù)據(jù)揭示：兩種檢測方法呈現(xiàn)高度吻合的生長動力學特征，其中2-16小時呈現(xiàn)典型的指數(shù)增長趨勢（對數(shù)期），16-20小時達到生長平臺（穩(wěn)定期），20小時后則進入菌體裂解階段（衰亡期）。特別針對對數(shù)期末期（16h）的定量分析表明，OD600值與活菌數(shù)存在顯著線性相關(guān)性，經(jīng)最小二乘法擬合獲得精準回歸方程y=2.7591x-0.0897（R2=0.9973），該數(shù)學模型為精準調(diào)控ORT培養(yǎng)進程提供了量化依據(jù)。
鼻氣管鳥桿菌病作為禽類呼吸道的重要疫病，其病原體ORT可通過氣溶膠快速傳播，臨床表現(xiàn)為特征性呼吸困難、發(fā)育遲滯及漸進性死亡。剖檢可見典型的"三炎"病變：肺臟纖維素性化膿灶、胸膜纖維蛋白滲出及氣囊混濁增厚。值得注意的是，ORT常與禽流感病毒（AIV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）等形成"病原體協(xié)同網(wǎng)絡(luò)"，通過免疫抑制效應顯著提升混合感染死亡率，據(jù)國際禽病學會統(tǒng)計，暴發(fā)疫情可導致禽群死亡率激增30%-50%，每年造成全球養(yǎng)禽業(yè)數(shù)億美元損失。該病原體最早由Devriese團隊于1994年從比利時病態(tài)火雞中分離鑒定，隨后呈現(xiàn)跨洲際傳播態(tài)勢，英國、以色列等15個國家相繼報道疫情。我國學者陳小玲于2003年首次分離到本土菌株，基因組測序顯示其與歐洲流行株存在顯著遺傳差異。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）最新監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，ORT的全球流行率正以每年8.7%的速率遞增，已成為威脅禽類健康的重大病原體。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種
試驗用鼻氣管鳥桿菌由本實驗室保存。
1.1.2培養(yǎng)基
普通肉湯培養(yǎng)基(PT)、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;脫脂綿羊血，慶大霉素、多黏菌素購自杭州天和微生物試劑有限公司。
1.1.3主要儀器
紫外分光光度計(德國艾本德公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(南京實驗儀器廠);臺式全溫振蕩器(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。
1.2方法
1.2.1比濁法測定生長曲線
取活化后鼻氣管桿菌，接種于5mL普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃，220r/min，培養(yǎng)16h，備用。將滅菌的普通肉湯培養(yǎng)基分裝于2個250mL的錐形瓶內(nèi)，每瓶30mL，分為試驗組和對照組，將菌種按照1%的接種量接種于試驗組的肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)。之后每兩小時取一次樣，測定試驗組與對照組在不同培養(yǎng)時間的OD600mm值,重復測定3次取平均值，記錄培養(yǎng)時間及對應OD600nm值。以O(shè)D600mm值為縱坐標，培養(yǎng)時間(t)為橫坐標繪制ORT生長曲線。
目前對ORT的研究集中在診斷檢測和防治技術(shù),對于ORT的生長曲線研究報道較少。本試驗主要采用光電比濁法和平板菌落計數(shù)法來繪制ORT的生長曲線，并通過測定不同濃度菌液的OD值與活菌數(shù)構(gòu)建回歸方程，研究該菌的繁殖規(guī)律。
1.2.2平板菌落計數(shù)法測定生長曲線
在5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基(5μg/mL慶大霉素，多黏菌素)傾倒于90cm平皿中,每個平皿約20mL培養(yǎng)基，放置于超凈臺中冷卻至凝固。將步驟1.2.1中不同時間的菌液，在超凈臺內(nèi)取出200μL菌液到1.5mL無菌EP管中，且將菌液10倍遞增稀釋梯度稀釋，取10°、10°、10°三個稀釋度的菌液各200μL,在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上進行涂布,每個稀釋度菌液重復涂布三個平皿，并吸取200μL稀釋液涂布平皿做空白對照,所有平皿于37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后對所有的平皿進行菌落計數(shù)，計數(shù)時選取菌落數(shù)在30~300，無蔓延菌落生長的平皿,并根據(jù)公式(每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復的平均菌落數(shù)x稀釋倍數(shù)x5)換算出樣品中的菌落數(shù),以菌落數(shù)(cfu)為縱坐標,培養(yǎng)時間(t)為橫坐標繪制鼻氣管鳥桿菌的生長曲線。
1.2.3菌液OD600nm值與菌落數(shù)(cfu)的相關(guān)性分析
挑取單菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中,37℃恒溫振蕩器培養(yǎng)16h。12000r/min離心5min取菌體，用滅菌的普通肉湯培養(yǎng)基重懸菌液，然后進行2倍遞增稀釋，將菌液稀釋至1/2、1/4、1/8、1/16、1/32,測定不同稀釋度菌液OD600mm值并進行平板菌落計數(shù)。根據(jù)所得結(jié)果,繪制以O(shè)D600nm值為橫坐標，菌落數(shù)(cfu)為縱坐標的標準曲線。
1.2.4回歸曲線準確度驗證
將1.2.1中所測的菌液培養(yǎng)不同時段的OD600nm值代入標準曲線,得出理論菌落數(shù)(cfu),并繪制出曲線與平板菌落計數(shù)法測定的生長曲線進行比較驗證。
2結(jié)果
2.1 ORT的生長曲線(比濁法)
由圖1可知,在2~16h曲線呈快速增長,ORT以幾何級數(shù)生長，為對數(shù)生長期;16~20h曲線平緩,ORT總數(shù)處于穩(wěn)定階段,為穩(wěn)定期;20h呈曲線呈緩慢下降趨勢,ORT總數(shù)下降,為衰亡期。
2.2 ORT的生長曲線(平板菌落計數(shù)法)
由圖2可知,ORT生長同樣分為3個時期:2~16h為對數(shù)生長期，16~20h為穩(wěn)定期，20h以后為衰亡期，與比濁法所得生長曲線走向基本一致，但相對于比濁法衰亡期下降更迅速。
2.3菌液OD600nm值與菌落數(shù)(cfu)的相關(guān)性分析
根據(jù)所測得OD600mm值及平板菌落數(shù)(cfu),以O(shè)D600mm值為橫坐標,菌落數(shù)(cfu)為縱坐標繪制的標準曲線(見圖3)。ORT對應方程為:y=2.7591x-0.0897(R2=0.9973),說明OD600mm值和菌落數(shù)(cfu)之間呈強相關(guān)性。
2.4回歸曲線準確度驗證
將平板菌落計數(shù)得到的菌落數(shù)(cfu)與代入方程計算得到的理論菌落數(shù)(cfu)比較,結(jié)果見圖4。由圖4可知,2~16h期間ORT的實際生長曲線與方程所得的理論曲線走勢基本重合，數(shù)值差異較小;而16h后曲線出現(xiàn)偏移,平板菌落計數(shù)得出的菌落數(shù)(cfu)數(shù)值明顯小于方程計算所得結(jié)果。因此該方程僅適用于ORT2~16h培養(yǎng)時間段內(nèi)的細菌計數(shù)。
3討論
本研究通過光電比濁法及平板菌落計數(shù)法測定ORT的生長曲線,兩種方法所得生長曲線走向基本一致,由此可得出ORT的生長周期:2~16h為對數(shù)生長期;16~20h為穩(wěn)定期;20h以后為衰亡期。本試驗所得的ORT生長曲線與付強等測定的A型ORT的生長曲線結(jié)果基本吻合。而后本試驗通過測定不同濃度菌液的OD值與活菌數(shù)構(gòu)建回歸方程，但是該方程僅適用于對數(shù)生長期的細菌，而這個時期細菌的形態(tài)以及生物活性等都很典型，并且對外界環(huán)境的作用敏感，因此研究細菌性狀以對數(shù)生長期的細菌最好。
本試驗發(fā)現(xiàn)，平板菌落計數(shù)法是將菌液經(jīng)梯度稀釋之后，取一定量的稀釋液接種于平皿上，在適宜條件下培養(yǎng)，由每個單細菌生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，由于待測菌液往往不易徹底分散成單個細菌，長成的單菌落也可能來自2~3個或更多細菌，因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低。平板菌落計數(shù)法雖然操作繁瑣，試驗成本高，結(jié)果滯后，但是該方法最大優(yōu)點是可以測定活菌的數(shù)量，所得結(jié)果更準確。而比濁法操作簡單，能即時獲得結(jié)果，適合連續(xù)測定，但是也存在缺點，在一定的范圍內(nèi)，菌液濃度與透光度成反比，而由于在穩(wěn)定期細菌代謝產(chǎn)物不斷累積，衰亡期細菌死亡數(shù)量增多，酶標儀所測得數(shù)值為細菌的總數(shù)，無法
區(qū)分活菌和死菌,使得衰亡期菌液的OD{}_{600text{nm}}值無明顯變化。因此，比濁法只能得出該菌各生長階段的大概時間，所得生長曲線無法普遍適用。本試驗選擇對數(shù)期的ORT,結(jié)合比濁法與平板菌落計數(shù)法,探究了OD600mm值及平板菌落數(shù)(cfu)的關(guān)系，成功構(gòu)建回歸方程，綜合兩種方法優(yōu)點的同時節(jié)約了時間和成本，有效地提高了ORT計數(shù)的準確性和簡便性，為下一步研究提供保障，為根據(jù)不同需要控制ORT的生長提供參考。
相關(guān)新聞推薦
2、鱖魚多肽-鋅螯合物對腐生葡萄球菌抑菌圈、過氧化氫酶活力、生長曲線的影響（二）