lmo1508/lmo1509基因缺失對單增李斯特菌生長曲線、抗氧化應(yīng)激能力的影響（四）
2.6 氧化條件下Δlmo1508/lmo1509缺失株中熒光值的檢測
選擇轉(zhuǎn)錄水平上升幅度最高且具有顯著差異性的Δlmo1508/lmo1509進(jìn)一步研究，TCS缺失株Δlmo1508/lmo1509的熒光值在BHI、5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+環(huán)境下極顯著高于參考菌株10403S（圖6），說明lmo1508/lmo1509對gsh-px具有負(fù)調(diào)控作用。
圖6 Δlmo1508/lmo1509中pFL516的表達(dá)
2.7 lmo1508/lmo1509缺失對LM生長能力的影響
生長能力測定結(jié)果顯示，缺失株Δlmo1508/lmo1509與親本株10403S在BHI培養(yǎng)基中的生長趨勢相似（圖7），表明lmo1508/lmo1509基因不影響菌株10403S的生長能力。
圖7 親本株10403S和缺失株Δlmo1508/lmo1509生長曲線測定
2.8 lmo1508/lmo1509缺失對LM抗氧化應(yīng)激能力的影響
通過氧化應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果得知，在5 mmol/L Cu2+應(yīng)激處理后，lmo1508/lmo1509缺失使得LM的存活能力顯著降低，10 mmol/L Fe3+的應(yīng)激處理后，lmo1508/lmo1509缺失使得LM的存活能力極顯著降低（圖8），說明lmo1508/lmo1509對LM的抗氧化應(yīng)激能力存在正調(diào)控影響。
A. 5 mmol/L Cu2+；B. 10 mmol/L Fe3+。
圖8 Δlmo1508/lmo1509在金屬離子中的存活率比較
3 討論
LM入侵宿主的過程中會遇到多種應(yīng)激條件，氧化應(yīng)激是其中最常見的一種。為了避免氧化損傷，LM產(chǎn)生強(qiáng)大的酶促抗氧化系統(tǒng)使胞內(nèi)促氧因子和抗氧因子保持平衡。
GSH-Px是一種重要的抗氧化酶，廣泛存在于真核生物和原核生物中。雖已知真核生物中GSH-Px可以利用GSH作為電子供體將過氧化物還原為水和氧，在介導(dǎo)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的過程中作用顯著，但是人們對原核生物中的GSH-Px知之甚少。此前，在原核生物中很少有關(guān)于gsh-px基因的報(bào)道。大腸桿菌中有編碼gsh-px的同源基因btuE，對其功能研究表明，這種酶可以防止各種氧化劑的有害影響，讓細(xì)胞對氧化應(yīng)激不那么敏感。腦膜炎奈瑟菌中g(shù)sh-px的同源基因gpoA的失活增加了該突變體對氧化還原循環(huán)劑百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的敏感性。這些研究均表明gsh-px參與了氧化應(yīng)激防御。另有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮下感染模型中，敲除gpoA的腦膜炎奈瑟菌毒力明顯受損，首次為gsh-px參與細(xì)菌致病性提供了證據(jù)。GSH-Px或許在原核生物的抗逆性和細(xì)菌毒力方面起著重要作用，但其具體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚。目前報(bào)告系統(tǒng)是研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要方法，其中GFP是一種經(jīng)典的報(bào)告系統(tǒng)。將目的基因的啟動(dòng)子與GFP相連后，對GFP的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定即可檢測基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，具有易于檢測、靈敏度高、熒光性質(zhì)穩(wěn)定、對細(xì)胞無毒害、可直接用于活細(xì)胞檢測等優(yōu)點(diǎn)，具有極廣泛的應(yīng)用前景。
本研究成功構(gòu)建gsh-px報(bào)告質(zhì)粒并將其電轉(zhuǎn)入LM野生株10403S感受態(tài)中。通過熒光顯微鏡和酶標(biāo)儀檢測Pgsh-px的表達(dá)情況，攜帶報(bào)告質(zhì)粒的LM菌株10403S-pFL516在顯微鏡下發(fā)出明亮的綠色熒光，且通過酶標(biāo)儀測得的熒光強(qiáng)度顯著高于野生對照株，該質(zhì)粒在LM中可表達(dá)GFP，表明該質(zhì)粒中攜帶的gsh-px啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄活性，為下一步試驗(yàn)奠定了良好基礎(chǔ)和技術(shù)平臺。
LM 10403S基因組編碼16組TCS，為了篩選可能參與調(diào)控gsh-px的TCS，我們試圖分別敲除每組TCS，但最終只成功敲除了14組。將報(bào)告質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)入14對TCS缺失株感受態(tài)中，通過測定熒光值，證實(shí)其中7個(gè)TCS的缺失導(dǎo)致gsh-px基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，說明它們與gsh-px啟動(dòng)子之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系；6個(gè)TCS的缺失則導(dǎo)致gsh-px基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，說明它們與gsh-px啟動(dòng)子之間存在正調(diào)控關(guān)系，lmo2500/lmo2501的缺失使得其熒光值相對于親本株而言無顯著差異。前期的研究中發(fā)現(xiàn)GSH-Px對H2O2帶來的氧化應(yīng)激不敏感，對銅和鐵金屬離子帶來的氧化應(yīng)激敏感。進(jìn)一步對轉(zhuǎn)錄水平上升幅度最高且具有顯著差異性的lmo1508/lmo1509這一TCS研究發(fā)現(xiàn)，在BHI、5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+條件下，Δlmo1508/lmo1509的熒光值極顯著高于親本株10403S，說明lmo1508/lmo1509對gsh-px具有負(fù)調(diào)控作用。生長能力測定結(jié)果表明lmo1508/lmo1509基因不影響菌株的生長；氧化應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果顯示，相對于親本株，Δlmo1508/1509的抗氧化應(yīng)激能力顯著降低，說明lmo1508/lmo1509對LM的抗氧化應(yīng)激能力存在正調(diào)控影響。
綜上所述，本研究利用gfp成功構(gòu)建了可以反映gsh-px啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的pFL516報(bào)告質(zhì)粒，并成功篩選出調(diào)控GSH-Px的雙元調(diào)控系統(tǒng)lmo1508/lmo1509，為進(jìn)一步探究該TCS在LM中如何調(diào)控GSH-Px的功能奠定了基礎(chǔ)。
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