lmo1508/lmo1509基因缺失對單增李斯特菌生長曲線、抗氧化應激能力的影響（一）
摘要：旨在構(gòu)建單增李斯特菌（LM）谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的綠色熒光蛋白（GFP）報告系統(tǒng)，篩選GSH-Px的調(diào)控因子，并驗證調(diào)控因子對LM生長能力和抗氧化應激能力的影響。通過重疊延伸PCR（SOE-PCR）方法，構(gòu)建攜帶gsh-px啟動子區(qū)域的gfp報告質(zhì)粒pFL516；通過測定攜帶報告質(zhì)粒的親本株10403S-pFL516熒光蛋白表達情況來驗證報告質(zhì)粒pFL516是否構(gòu)建成功；通過測定報告質(zhì)粒pFL516在親本株10403S和各雙元調(diào)控系統(tǒng)缺失株里的轉(zhuǎn)錄水平來篩選GSH-Px的調(diào)控因子；生長曲線檢測該調(diào)控因子缺失對LM生長能力的影響；通過氧化應激存活試驗，測定該調(diào)控因子缺失對LM抗氧化應激能力的影響。結(jié)果：PCR檢測顯示報告質(zhì)粒pFL516成功構(gòu)建并電轉(zhuǎn)入14對雙元調(diào)控系統(tǒng)缺失株，其中7對雙元調(diào)控系統(tǒng)的缺失導致gsh-px基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，6對雙元調(diào)控系統(tǒng)的缺失則導致gsh-px基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，1對雙元調(diào)控系統(tǒng)缺失后gsh-px的轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異。選取雙元調(diào)控系統(tǒng)lmo1508/lmo1509進一步研究發(fā)現(xiàn)，在非脅迫和金屬離子脅迫條件下雙元調(diào)控系統(tǒng)lmo1508/lmo1509缺失株的gsh-px轉(zhuǎn)錄水平顯著高于親本株10403S，說明lmo1508/lmo1509負調(diào)控gsh-px的轉(zhuǎn)錄水平；生長曲線結(jié)果表明lmo1508/lmo1509基因缺失不影響10403S菌株的生長能力，應激存活試驗結(jié)果表明，lmo1508/lmo1509缺失顯著降低LM在氧化應激條件下的存活率，表明lmo1508/lmo1509對LM的抗氧化應激能力存在正調(diào)控。結(jié)果表明，在LM中成功構(gòu)建gsh-px的報告系統(tǒng)，并篩選出調(diào)控gsh-px的調(diào)控因子lmo1508/lmo1509，為深入了解雙元調(diào)控系統(tǒng)與LM抗氧化酶GSH-Px之間的調(diào)控關(guān)系提供了重要的研究工具。
單增李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM）是一種革蘭陽性、兼性厭氧的食源性致病菌，通常經(jīng)污染的食品進入人類和動物體內(nèi)，可穿透腸道屏障進入血液，然后通過血液循環(huán)突破血腦屏障和胎盤屏障，進而引發(fā)嚴重的李斯特菌病。該病對老人、嬰幼兒及孕婦等免疫力低下的人群危害極大，主要癥狀表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)甚至死亡。
LM在自然界中無處不在，可以在多種不利環(huán)境，如強酸、強堿、高滲透壓、低溫和氧化應激環(huán)境中生存，這一特性對食品環(huán)境安全構(gòu)成了嚴重的威脅。氧化應激是最常見的一種不利環(huán)境，LM所面臨的氧化應激包括活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、活性氯（RCS），體內(nèi)活性物質(zhì)過多使氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡造成氧化損傷，氧化損傷會對細菌產(chǎn)生不良影響，如脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA損傷，甚至可能導致細胞死亡。LM在宿主胞內(nèi)存活的關(guān)鍵在于平衡胞內(nèi)的活性物質(zhì)并將損傷的DNA和蛋白質(zhì)進行修復和清除。因此LM需要強大的抗氧化系統(tǒng)對抗因活性物質(zhì)過量造成的危害。LM的抗氧化系統(tǒng)主要分為兩類：非酶促和酶促，其中非酶促抗氧化系統(tǒng)包含多類非酶類抗氧化物質(zhì)，如抗壞血酸、谷胱甘肽、生育酚、維生素E、類胡蘿卜素和脯氨酸等，酶促則是LM可利用各類清除酶抵抗氧化應激。LM中經(jīng)典的酶促抗氧化防御系統(tǒng)由硫氧還蛋白、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶及谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶等組成，它們協(xié)同作用幫助LM抵抗氧化應激。
雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)（TCS），又稱雙元調(diào)控系統(tǒng)，廣泛存在于細菌中，參與調(diào)控細菌的一系列生物學過程，如細胞分裂、環(huán)境代謝的適應性、群體感應、生物被膜的形成和毒力基因的表達等。典型的細菌TCS由組氨酸傳感激酶（HK）和應答調(diào)節(jié)蛋白（RR）組成。
谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）在真核生物中是抗氧化系統(tǒng)中一種重要的抗氧化酶，但在原核生物中的研究很少。GSH-Px在細胞降解過氧化氫和有機氫過氧化物的過程發(fā)揮顯著作用。因為綠色熒光蛋白（GFP）具有熒光穩(wěn)定且在各物種中均能穩(wěn)定表達的優(yōu)點，所以為了深入研究GSH-Px在LM中的作用，本文成功構(gòu)建GSH-Px綠色熒光報告系統(tǒng)并通過該報告系統(tǒng)篩選調(diào)控GSH-Px的調(diào)控因子，為GSH-Px在LM中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 菌株與載體
LM參考菌株10403S（血清型為1/2a型）、大腸桿菌DH5α、攜帶gfp片段的質(zhì)粒pFL251、載體質(zhì)粒pERL3均由本實驗室保存；LM的14個TCS缺失株由本實驗室前期構(gòu)建并保存，其缺失的TCS具體信息及主要功能見表1。
表1 LM的14個TCS缺失株所缺基因信息
1.2 主要試劑
2×Taq Plus Master Mix Ⅱ購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；核酸染料Goldview購于上海自賽百盛公司；瓊脂糖、DNA Marker購自擎科生物有限公司；限制性內(nèi)切酶SalⅠ購自NEB公司；重組連接酶購于艾德萊生物有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、紅霉素（EM）均購自Sigma-Aldrich公司；腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；LB培養(yǎng)基購自北京陸橋生物科技有限公司。
1.3 引物設(shè)計
LM中l(wèi)mo0983編碼gsh-px，而通過生物信息學網(wǎng)站www.biocyc.org查詢得知lmo0982和lmo0983共用1個啟動子。以LM參考菌株10403S基因組為模板，選取lmo0982和lmo0983基因前600 bp序列通過啟動子預測網(wǎng)站（Promoter Prediction by Neural Network）預測出gsh-px的啟動子區(qū)域，并參照gfp基因序列通過Vector NTI軟件設(shè)計擴增引物（表2），引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。
表2 引物序列信息
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