林氏扇頭蜱抗菌肽重組蛋白對大腸埃希菌生長曲線影響及抑菌效果（四）
2.4.3不同濃度重組蛋白對大腸埃希菌生長曲線、時間-殺菌曲線的影響
從生長曲線中可看出，空白對照組在培養(yǎng)2 h后進(jìn)入快速對數(shù)生長期，并于9 h時達(dá)到穩(wěn)定期。相比之下，1/8×MIC處理組雖能抑制大腸埃希菌的生長，但抑制作用較弱；1/4×MIC處理組顯著抑制了大腸埃希菌的生長，菌體數(shù)量直至10 h后才開始增加；而1/2×MIC、1×MIC處理組則完全抑制了大腸埃希菌的生長。除6 h時對照組與1/8×MIC處理組的OD600 nm差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余時間各處理組的OD 600 nm均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），重組蛋白能延緩大腸埃希菌的生長速度，且其抑菌活性呈現(xiàn)濃度依賴性。見圖3A。
圖3不同濃度Microplusin-like對大腸埃希菌生長曲線（A）和時間-殺菌曲線（B）的影響
時間-殺菌曲線顯示，與對照組相比，經(jīng)重組蛋白處理的大腸埃希菌活菌數(shù)在5 min內(nèi)均下降（P<0.05）；1×MIC處理組曲線在15 min內(nèi)略有下降，隨后趨于平穩(wěn)并略有上升，說明該濃度蛋白對大腸埃希菌有一定的抑制作用，但未能有效殺滅細(xì)菌；4×MIC處理組曲線顯著下降，在60 min左右達(dá)到最低點，隨后略有上升，說明該濃度藥物具有較強(qiáng)的殺菌活性，使菌落形成單位數(shù)大幅降低，重組蛋白濃度與殺菌效果呈正相關(guān)。見圖3B。
2.5重組蛋白抑菌機(jī)制探究
2.5.1電子顯微鏡分析
與對照組相比，經(jīng)重組蛋白處理后的細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁出現(xiàn)破損，內(nèi)容物外泄，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部松散（圖4A~圖4B），菌體明顯皺縮，邊緣模糊，菌體間相互粘連（圖4C~圖4D）。
圖4經(jīng)Microplusin-like處理后大腸埃希菌透射電鏡（TEM）及掃描電鏡圖（SEM）注：紅色箭頭為菌體受損部位；A、B、D.×20 000；C.×22 000。
2.5.2分子對接
Microplusin-like三維模型由6段α-螺旋結(jié)構(gòu)盤旋而成的相對緊湊的穩(wěn)定折疊形態(tài)，具有3個二硫鍵（圖5A~圖5B）。在Microplusin型蛋白中，二硫鍵有助于整體折疊的穩(wěn)定性，特別是保持α-螺旋的位置。對結(jié)構(gòu)進(jìn)行PROCHECK評估，97.6%的殘基落在最理想的區(qū)域（圖5C），這些區(qū)域代表了穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，高比例的核心區(qū)域表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)大致符合理想構(gòu)象，可用于后續(xù)分析。
圖5 Microplusin-like的三維結(jié)構(gòu)模型及PROCHECK評估結(jié)果注：A.Microplusin-like三維結(jié)構(gòu)模型；B.Microplusin-like的Carton結(jié)合Sticks結(jié)構(gòu)；C.PROCHECK評分圖。
Microplusin-like重組蛋白與脂多糖轉(zhuǎn)運蛋白（4RHB）分子對接的最佳構(gòu)象所示，2個蛋白主要通過氫鍵進(jìn)行接觸，二者之間的多個氨基酸如：4RHB的Arg657、Lys346、His785、Arg623、Glu573、Arg565、Ser318、Arg326與重組蛋白的Glu67、His89、Asp87、Ser66、Thr33、Gln58、Ala62、Ala78、Thr14形成氫鍵；His785和Asp55形成鹽橋。在分子對接結(jié)果2D可視化圖中能看到相同的作用。此外，重組蛋白還與Arg542、Thr258、Glu275、Ser446、Asn782、Thr783、Asn328、Tyr613、Leu784、Lys490、Gln781、Arg511、Gln366、Val572、Asn576、Leu533、Gln323、Arg277、Leu279、Asn369產(chǎn)生疏水相互作用。見圖6~圖7。
圖6 Microplusin-like與脂多糖轉(zhuǎn)運蛋白的分子對接結(jié)果注：A.Microplusin-like與4RHB對接構(gòu)象Surface模型，紫色代表Microplusin-like，藍(lán)色代表4RHB；B.Microplusin-like與4RHB對接構(gòu)象Carton模型；C.Microplusin-like與4RHB對接構(gòu)象細(xì)節(jié)圖，蛋白1的碳原子顯示為藍(lán)色，其中黃色虛線為形成的氫鍵，綠色虛線為形成的鹽橋。
圖7分子對接結(jié)果2D可視化注：綠色虛線為形成的氫鍵，紅色虛線為鹽橋作用；黑色為C原子，紅色為O原子；藍(lán)色為N原子；扇形標(biāo)記氨基酸為涉及疏水接觸的非配體殘基。
3討論
蜱是一類以吸血為生的節(jié)肢動物，不僅生活在適合微生物繁殖的潮濕、復(fù)雜的環(huán)境中，在吸血過程中也隨時面臨病原微生物的入侵。節(jié)肢動物缺通常乏獲得性免疫系統(tǒng)，主要依賴先天性免疫系統(tǒng)來抵御病原體入侵，抗菌肽是昆蟲先天免疫系統(tǒng)中的一類重要的免疫效應(yīng)因子，不僅能直接清除入侵的細(xì)菌、真菌等病原微生物，還具有介導(dǎo)免疫細(xì)胞趨化、調(diào)控細(xì)胞凋亡、促進(jìn)免疫應(yīng)答和傷口愈合等生物學(xué)功能，在蜱生物防治及開發(fā)新型抗菌藥物中具有發(fā)展?jié)摿Α?
本試驗通過生物信息學(xué)方法分析林氏扇頭蜱抗菌肽Microplusin-like基因，CAMPR3在線網(wǎng)站涵蓋了原核生物和真核生物抗菌肽序列、結(jié)構(gòu)及家族特異性特征，通過該數(shù)據(jù)庫檢索和對抗菌肽家族特征檢索，能夠預(yù)測蛋白序列是否具有抑菌性；CAMPR3利用多種算法，如支持向量機(jī)、隨機(jī)森林等來預(yù)測，給出一個0~1的概率分?jǐn)?shù)，分?jǐn)?shù)>0.5的序列具有潛在抑菌活性，分?jǐn)?shù)越高，表示蛋白為抗菌肽的可能性越大；GRAVY反映的是整體親水性（負(fù)值為親水），GRAVY為負(fù)值的抗菌肽可能通過破壞細(xì)菌膜（疏水區(qū)）發(fā)揮作用，但其自身需要具備一定親水性以溶于液體，為后續(xù)發(fā)揮抗菌作用奠定基礎(chǔ)；Wimley-White專注于膜界面局部的疏水性（正值為疏水）；Boman index指數(shù)較高（2.50~3.00）意味著抗菌肽于細(xì)胞內(nèi)部具備多樣化的功能特性，這是由于它能夠和多種不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生相互作用，與之相反，數(shù)值越低（≤1），表明抗菌肽副作用越?。ū热缛苎钚蕴幱谳^低水平），僅具備單一抗菌功能的概率較大。生物信息學(xué)預(yù)測顯示該蛋白具有潛在抑菌活性，這與后續(xù)試驗中重組蛋白對革蘭陰性菌的抑制作用相呼應(yīng)，說明預(yù)測方法具有一定的參考價值。
抑菌試驗結(jié)果顯示，重組蛋白對大腸埃希菌及沙門菌等革蘭陰性菌具有抑制作用，表現(xiàn)出中度或高度敏感。不同菌株的抑菌圈直徑、MIC和MBC數(shù)據(jù)表明其抑菌活性存在差異，這可能與菌株的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、膜通透性以及耐藥機(jī)制不同有關(guān)。而對金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌無效，這與已知的微小扇頭蜱種的Microplusin對革蘭陽性菌具有抑制效果的研究結(jié)果有所不同，可能是氨基酸序列差異、蛋白表達(dá)后修飾不同導(dǎo)致，這一推測有待進(jìn)一步研究。從抑菌活性的濃度依賴性來看，隨著重組蛋白濃度增加，對大腸埃希菌的抑制和殺菌效果增強(qiáng)，在生長曲線和時間-殺菌曲線試驗中均有明顯體現(xiàn)。但在4×MIC濃度下，細(xì)菌數(shù)量后期仍會回升，可能是蛋白濃度不夠高，或者細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性或適應(yīng)性，這與臨床抗菌藥物使用中面臨的問題相似。透射電鏡及掃描電鏡結(jié)果表明，重組蛋白能夠損傷菌體細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，使其內(nèi)部物質(zhì)泄漏，還可觀察到重組蛋白使胞內(nèi)密度明顯降低，有可能是直接干擾了細(xì)胞內(nèi)過程，從而達(dá)到殺菌效果。脂多糖轉(zhuǎn)運蛋白（4RHB）是大腸埃希菌細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)，它們的抑制劑被認(rèn)為是治療細(xì)菌感染的有效候選化合物。分子對接用于研究多肽與指示菌關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用，分子對接結(jié)果表明重組蛋白與大腸埃希菌外膜脂多糖轉(zhuǎn)運蛋白會產(chǎn)生相互作用也驗證了重組蛋白能破壞外膜穩(wěn)定性，與微小扇頭蜱Microplusin蛋白通過螯合銅離子抑制菌的呼吸的抑菌機(jī)制有所不同，但也不排除多種機(jī)制共同作用，這有待進(jìn)一步的研究。
本試驗成功構(gòu)建pCold-SUMO/Microplusin-like重組表達(dá)載體，其表達(dá)產(chǎn)物具有抗大腸埃希菌及沙門菌等革蘭陰性菌活性，初步分析抗菌機(jī)制為破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，為開發(fā)新型生物活性抑菌劑的研發(fā)提供了新的可能性。
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