溫室大棚內(nèi)不同微生物菌劑對(duì)秸稈降解率影響（培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)方法）
秸稈是一種天然的農(nóng)業(yè)可再生資源和理想的肥料資源[1]。有數(shù)據(jù)顯示，100 g秸稈中含碳44.2 g、氮0.62 g、磷(五氧化二磷)0.25 g、鉀(氧化鉀)1.44 g，以及鈣、鎂、硫、硅、鐵、鋅、錳、鉬等中、微量元素[2]。我國(guó)農(nóng)作物秸稈每年產(chǎn)量約7億t，其中玉米秸稈占30%左右[3-4]，東北地區(qū)是我國(guó)重要的糧食主產(chǎn)區(qū)，每年產(chǎn)生的玉米秸稈總量達(dá)1.7億t，秸稈資源十分豐富[5]。秸稈還田是將秸稈直接或間接還田的一種處理方法[6]，是一種強(qiáng)化土壤有機(jī)質(zhì)積累、調(diào)節(jié)土壤溫度和水分的方式[7]。秸稈還田技術(shù)的合理利用可緩解土壤質(zhì)量下降及秸稈資源浪費(fèi)的情況[8]，可以增加土壤有機(jī)碳含量，提升土壤肥力[9]，同時(shí)也是在目前全球變暖條件下，如何利用土壤碳截流減緩溫室效應(yīng)所追求的目標(biāo)[10]。秸稈還田對(duì)提高氮素有效性有促進(jìn)作用[11]，有研究顯示土壤微生物量碳氮均呈現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)，表明土壤中的微生態(tài)環(huán)境得到了很大改善[12]。張旸等[13]研究發(fā)現(xiàn)，秸稈還田增加了土壤中碳氮磷鉀的積累量。
李辛等[7]研究發(fā)現(xiàn)秸稈還田能顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀的含量，同時(shí)還增加了5～15 cm土層的土壤容重，降低了15～25 cm土層的土壤容重。秸稈還田可影響土壤結(jié)構(gòu)，改善土壤微生態(tài)[14]，增加土壤微生物代謝和多樣性[15]。同時(shí)，深層土壤在連續(xù)秸稈淺耕還田后，明顯改善了土壤透氣性，并有效降低了土壤容重[16]。秸稈降解所用的腐解菌劑是一類能夠產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶等的微生物菌劑[17]。由于農(nóng)作物秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，自然狀態(tài)下難以被微生物分解。添加微生物菌劑可以加快秸稈的腐解，秸稈還田既可充分利用秸稈資源為農(nóng)田提供大量?jī)?yōu)質(zhì)有機(jī)肥料，同時(shí)可減輕秸稈焚燒造成的生態(tài)環(huán)境污染，是發(fā)展有機(jī)可持續(xù)農(nóng)業(yè)的有效途徑[18-19]。
秸稈原位直接還田是目前我國(guó)采用的主要還田方式，該方式存在秸稈腐解較慢、對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)成分提升不明顯等問(wèn)題[20]。秸稈還田配合使用腐解菌劑可以促進(jìn)秸稈腐解，使土壤養(yǎng)分增加[21-22]。李祥等[23]采用秸稈+尿素+自制微生物菌劑+土壤調(diào)理劑的模式還田，還田10個(gè)月，小麥秸稈腐解率達(dá)100%，有效改善了土壤結(jié)構(gòu)，并使土壤有機(jī)質(zhì)含量增加。范作偉等[17]在秸稈淺旋和旋耕還田方式下，施用腐解菌劑處理的秸稈腐解率顯著高于未施用菌劑的處理。馮敏等[24]研究表明，秸稈還田能有效增加土壤中氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌和固氮菌的數(shù)量并使其活性增強(qiáng)，進(jìn)而提高土壤氨化活性和硝化活性，而相關(guān)菌群數(shù)量的變化與土壤氨化活性和硝化活性呈正相關(guān)。楊冬靜等[25]研究發(fā)現(xiàn)，水稻秸稈還田可提高土壤中細(xì)菌多樣性，小麥秸稈還田可提高土壤真菌多樣性，其他還田方式也對(duì)土壤微生物的多樣性有一定程度的影響，說(shuō)明稻麥秸稈還田改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)以及微生物菌群的相對(duì)豐度。
此外，Yu等研究發(fā)現(xiàn)，秸稈還田可提高土壤微生物的數(shù)量和活性[26]，土壤微生物數(shù)量和活性的提高對(duì)秸稈的腐解又起到促進(jìn)作用[27]，表明秸稈還田與土壤微生物之間是相互促進(jìn)相互影響的。
為明確不同微生物菌劑在秸稈降解中的作用及對(duì)秸稈中微生物菌群數(shù)量的影響，本研究在溫室大棚內(nèi)進(jìn)行不同菌劑對(duì)秸稈降解率影響試驗(yàn)，并研究秸稈中可培養(yǎng)真菌、細(xì)菌、放線菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化，以期為微生物菌劑在秸稈還田中的應(yīng)用提供參考。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試材料地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)由遼寧省微生物菌種保藏中心提供。玉米秸稈(喀左天盛農(nóng)業(yè)科技有限公司提供)風(fēng)干，去除葉片，切段(長(zhǎng)10～15 cm)，105℃烘箱烘干至恒重備用。60目尼龍濾布(購(gòu)自化試商店)剪成50 cm×50 cm方塊備用。
1.1.2試驗(yàn)區(qū)試驗(yàn)時(shí)間為2020年10月至2021年4月，試驗(yàn)地點(diǎn)為遼寧省喀左天盛農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)基地溫室大棚。
1.1.3培養(yǎng)基①NA培養(yǎng)基:用于培養(yǎng)細(xì)菌;②PDA培養(yǎng)基:用于培養(yǎng)真菌;③改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基:用于培養(yǎng)放線菌。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。
1.1.4主要試劑與儀器設(shè)備生理鹽水(稱取氯化鈉4.5 g，加入蒸餾水500 mL，充分?jǐn)嚢枞芙猓?21℃滅菌20 min，備用)。氯化鈉、牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖等試劑均為分析純。高壓滅菌鍋；恒溫培養(yǎng)箱；烘箱；電子天平；全溫振蕩器。
1.2方法
1.2.1微生物菌劑制備①菌種活化:在保藏試管中挑取地衣芽胞桿菌菌體于NA試管培養(yǎng)基上劃線，35℃避光培養(yǎng)3 d。挑取哈茨木霉菌絲于PDA試管培養(yǎng)基上劃線，28℃避光培養(yǎng)至表面全部變綠。②菌劑制備:挑取活化好的地衣芽胞桿菌至NA液體培養(yǎng)基，35℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，活菌數(shù)約為0.5×108cfu/mL，備用;哈茨木霉試管中加無(wú)菌生理鹽水，制成菌懸液，涂布于PDA平板，28℃避光培養(yǎng)至表面全部變綠，用無(wú)菌生理鹽水將孢子刮下，制成孢子懸液，活菌數(shù)調(diào)至0.5×108cfu/mL。
1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理。對(duì)照組:玉米秸稈;處理1:玉米秸稈+哈茨木霉;處理2:玉米秸稈+哈茨木霉+地衣芽胞桿菌。用修枝剪刀將玉米秸稈剪成長(zhǎng)10～15 cm秸稈段，用剪好的尼龍濾布包裹秸稈段，每袋100 g，共計(jì)27袋。挖9個(gè)長(zhǎng)50 cm、寬50 cm、深30 cm的土坑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行土坑，每個(gè)土坑放置3袋秸稈為3個(gè)平行樣。秸稈中分別按0.2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量加入無(wú)菌水、哈茨木霉、哈茨木霉+地衣芽胞桿菌，覆土厚20 cm并壓實(shí)，澆水并保持土壤水潤(rùn)，每隔30 d，3個(gè)處理各取1個(gè)土坑的秸稈(3袋同時(shí)取出)，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。
1.2.3秸稈降解率測(cè)定取出各處理秸稈，稱量鮮重，然后用自來(lái)水沖洗，去掉泥土及被分解成粉狀的腐殖質(zhì)，105℃烘干至恒重，稱量干重，計(jì)算降解率。計(jì)算公式:降解率(%)=((100-干重)/100)×100%。
1.2.4活菌數(shù)測(cè)定活菌數(shù)采用稀釋平板法測(cè)定。①可培養(yǎng)細(xì)菌活菌數(shù)測(cè)定:取出各處理秸稈，稱取濕重5.0 g，用無(wú)菌剪刀剪碎(0.5 mm×0.5 mm)，置于裝有95.0 mL無(wú)菌生理鹽水的帶有玻璃珠的250 mL無(wú)菌錐形瓶中，置振蕩器中160 r/min振搖30 min，充分混勻后，取上清液1 mL，加無(wú)菌生理鹽水9 mL，制成10倍稀釋液，之后按10倍梯度關(guān)系稀釋，分別取10-3、10-4、10-5、10-6稀釋倍液0.1 mL涂平板，平行制備3個(gè)平板，30℃倒置培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。②可培養(yǎng)真菌活菌數(shù)測(cè)定:樣品處理同①，分別取10-2、10-3、10-4、10-5稀釋倍液0.1 mL涂平板，平行制備3個(gè)平板，28℃倒置培養(yǎng)3 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。③可培養(yǎng)放線菌活菌數(shù)測(cè)定:樣品處理同①，分別取10-2、10-3、10-4、10-5稀釋倍液0.1 mL涂平板，平行制備3個(gè)平板，28℃倒置培養(yǎng)3 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
溫室大棚內(nèi)不同微生物菌劑對(duì)秸稈降解率影響（培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)方法）
不同微生物菌劑處理對(duì)秸稈降解率、可培養(yǎng)細(xì)菌/真菌/放線菌數(shù)量影響
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