白馬耳組織成纖維細胞體外培養(yǎng)、冷凍前及復(fù)蘇后存活率、生長曲線繪制（二）
1.2.3烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞凍存前及復(fù)蘇后存活率測定
當(dāng)細胞生長狀態(tài)良好時，按照1.2.1中細胞傳代方法得到細胞懸液，通過計數(shù)得到細胞總數(shù)。取40μl有2.0x 10個細胞的細胞懸液，按照臺盼藍染色計數(shù)說明書的染色比例加入10μl已過濾的臺盼藍染液，混勻靜置7min(劉剛等2013)，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計死細胞數(shù)目(死細胞呈藍色)，將其余細胞在液氮中凍存保存1個月后解凍，離心后獲得細胞沉淀，加入5ml培養(yǎng)液制得細胞懸液，并按上述染色方法進行染色，計數(shù)統(tǒng)計細胞總數(shù)及死細胞數(shù)。通過統(tǒng)計得到細胞凍存前、復(fù)蘇后細胞總數(shù)與死細胞數(shù)目，并根據(jù)以下公式計算得到凍存前、復(fù)蘇后的細胞存活率:細胞存活率=100%[(細胞總數(shù)-死細胞數(shù))/細胞總數(shù)]。
1.2.4烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的生長曲線繪制
當(dāng)細胞生長狀態(tài)良好時，按1.2.1中細胞傳代方法處理細胞以得到細胞懸液，統(tǒng)計細胞總數(shù)。取2.4x105個細胞，用24ml培養(yǎng)液混勻后制成細胞懸液。24孔細胞培養(yǎng)板每孔接種1.0x104個細胞，每3孔細胞為一組，共8組，將24孔細胞培養(yǎng)板置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24h后每天相同時間統(tǒng)一計數(shù)一組細胞的數(shù)目，通過計算得出對應(yīng)生長天數(shù)的細胞總數(shù):細胞總數(shù)=(細胞數(shù)/體積)x總體積x稀釋倍數(shù)。按相同方法計數(shù)8d并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。根據(jù)計算得到第1至第8天對應(yīng)的細胞總數(shù)，Biosense微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)自動繪制細胞生長曲線圖。依據(jù)以下公式計算烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞群體倍增時間:D_{T}=tleft[lg 2/left(lg N_{t}-lg N_{0}right)right]，式中，D_{T}為細胞倍增時間，t細胞培養(yǎng)時間，Nt細胞培養(yǎng)t時的細胞數(shù)目，N0細胞開始進入對數(shù)生長期第1天的細胞數(shù);依據(jù)以下公式計算烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞群體倍增次數(shù):X=(lgN2-lgN1)/lg2，式中，N1細胞接種時的細胞數(shù)目，N2細胞生長至對數(shù)期末時的數(shù)目。
通過測定不同時間烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的數(shù)量，得到細胞總數(shù)與時間的關(guān)系，據(jù)此繪制出細胞的生長曲線圖，實驗重復(fù)3次。根據(jù)實驗需要繪制每隔3代的細胞生長曲線圖(Li et al.2020)。
1.2.5烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的貼壁率測定
本實驗對烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞進行細胞貼壁率測定，以確定傳代的成纖維細胞生長、增殖狀態(tài)。在細胞生長狀態(tài)良好時，根據(jù)1.2.1中細胞傳代方法對細胞進行處理，得到細胞沉淀。1ml培養(yǎng)液充分混勻細胞，統(tǒng)計細胞總數(shù)。6孔細胞培養(yǎng)板每孔鋪板處理后加入2ml培養(yǎng)液，均勻接種2x105個細胞，重復(fù)3孔，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在細胞培養(yǎng)6h、12h、24h時進行未貼壁細胞數(shù)目統(tǒng)計。輕晃細胞培養(yǎng)板后均勻吸取100μl培養(yǎng)液，利用血球計數(shù)板重復(fù)計數(shù)3次，按以下公式計算得細胞貼壁率，貼壁率=100%[(接種細胞數(shù)-未貼壁細胞數(shù))/接種細胞數(shù)]。
1.2.6烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞染色體核型
選取處于生長對數(shù)期的細胞，每1ml原細胞培養(yǎng)液中添加5μl秋水仙素(20mg/L)，每瓶中加入25μl秋水仙素并置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中處理2.5h使細胞停在分裂中期(郭晶營等2018)。秋水仙素處理細胞結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)液，按1.2.1中細胞傳代方法得到細胞沉淀。加入8mlKCl溶液(0.075mol/L)重懸細胞沉淀，充分混勻后將離心管放入37℃恒溫水浴鍋中低滲40min。在低滲結(jié)束前1min加入1ml提前預(yù)冷的固定液(甲醛與冰乙酸體積比為3:1)進行預(yù)固定。預(yù)固定結(jié)束后離心(1000r/min，10min)收集細胞沉淀。隨后在離心管中加入8ml已預(yù)冷的固定液重懸細胞沉淀，輕輕顛倒混勻后置于37℃恒溫水浴鍋中固定30min，離心(1000r/min，10min)得到細胞沉淀。該步驟重復(fù)3次。得到細胞沉淀后根據(jù)細胞量加入300~500μl固定液重懸細胞沉淀，吹打混勻。在距已預(yù)冷的載玻片垂直距離約為1.6m處使細胞懸液均勻滴落，再把載玻片放入烘箱中70℃烘干2h，室溫冷卻或室溫干燥12h。使用Giemsa染液(2.5mlGiemsa母液溶于47.5ml超純水中并過濾)染色10~15 min，沖洗掉載玻片背面浮色，自然晾干后即可在顯微鏡下觀察拍照，統(tǒng)計染色體數(shù)目。
2結(jié)果
2.1烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞培養(yǎng)形態(tài)觀察
對雄性(圖1a)和雌性(圖1b)烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞原代建系培養(yǎng)。雄性耳組織在培養(yǎng)5~6d時沿著組織塊附近新長出的紡錘形或三角形細胞，確定為成纖維細胞，也有部分細胞形態(tài)為扁平不規(guī)則多角形，視為上皮細胞。培養(yǎng)10~12d后，培養(yǎng)瓶中細胞匯合度達到60%且成纖維細胞優(yōu)勢生長，在顯微鏡下觀察細胞間有空隙且呈現(xiàn)漩渦狀生長。培養(yǎng)13~15d后，培養(yǎng)瓶中細胞匯合度達到80%以上。雌性耳組織細胞生長速度快于雄性耳組織成纖維細胞，在3d后細胞沿組織塊周圍長出。雌性耳組織成纖維細胞形態(tài)及長勢與雄性耳組織成纖維細胞基本相同，因此，后續(xù)實驗選用成纖維細胞進行細胞傳代培養(yǎng)及生物學(xué)特性分析。
由于成纖維細胞與上皮細胞相比對酶消化液的敏感程度不同，用0.25%胰酶消化液處理，經(jīng)傳代純化培養(yǎng)后，得到較純的成纖維細胞。雄性和雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞經(jīng)過細胞傳代培養(yǎng)(圖2)，均最多培養(yǎng)到80代(P80)。細胞呈現(xiàn)三角形，隨著細胞培養(yǎng)代次的增加，細胞生長匯合度達到80%以上需要的時間變長，且細胞形態(tài)由立體狀三角形形態(tài)逐漸變?yōu)楸馄讲灰?guī)則多邊形形態(tài)。兩種耳組織成纖維細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)到后期，雄性耳組織成纖維細胞生長明顯優(yōu)于雌性耳組織成纖維細胞，且雌性耳組織成纖維細胞的形態(tài)略微扁平，整體呈現(xiàn)長梭形。
2.2烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞支原體檢測
細胞培養(yǎng)過程對環(huán)境以及操作步驟的潔凈度要求非常高，在細胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物非常容易因為操作不當(dāng)?shù)仍蚨艿轿廴荆瑥亩鴮χ蟮膶嶒灝a(chǎn)生影響，其中，支原體污染較為普遍且不易被發(fā)現(xiàn)，因此選擇培養(yǎng)的耳組織細胞5代(P5)時進行檢測。被檢測的雄性、雌性耳組織成纖維細胞均為357bp的單一條帶，與支原體檢測陰性模板一致(圖3)，說明雄性、雌性耳組織成纖維細胞培養(yǎng)過程中均未受到支原體的污染。
Maker.2 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1.支原體檢測陽性模板;2.支原體檢測陰性模板;3.雄性耳組織成纖維細胞;4.雌性耳組織成纖維細胞。
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