HIV感染者口腔白假絲酵母菌的群體生長規(guī)律研究方法與結(jié)果
目的：了解HIV感染者口腔白假絲酵母菌的群體生長規(guī)律，為口腔念珠菌病的發(fā)病機(jī)理研究、診斷及防治提供基礎(chǔ)。方法：將108株經(jīng)兩次激活的分離自HIV感染者和健康人群口腔的白假絲酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)15 h，每間隔1 h取樣采用血球計(jì)數(shù)板活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)，同時用酶標(biāo)儀測定OD600值，繪制生長曲線并計(jì)算代時。結(jié)果：繪制了分離自HIV感染者和健康人口腔的白假絲酵母菌的生長曲線，0～3 h為遲緩期，4～10 h為對數(shù)生長期，穩(wěn)定期開始于10 h，兩組白假絲酵母菌的生長曲線基本相似。108株白假絲酵母菌的代時為1.568 h，其中HIV感染者白假絲酵母菌代時為1.354 h，健康人群白假絲酵母菌的代時為1.782 h，HIV感染者來源的白假絲酵母菌生長速度比健康人群來源的白假絲酵母菌快0.428 h，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：HIV感染者和健康人群口腔白假絲酵母菌的生長曲線各個時期基本一致，HIV感染者口腔白假絲酵母菌生長速率較健康人群稍快，在口腔念珠菌病致病中的作用需要進(jìn)一步研究。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)菌株及菌株的激活分離自云南地區(qū)HIV感染者、健康人群的口腔白假絲酵母菌各54株，經(jīng)形態(tài)染色、培養(yǎng)特性、芽管形成試驗(yàn)、假菌絲及厚膜孢子形成試驗(yàn)、YBC酵母鑒定卡及CHROMagar培養(yǎng)基培養(yǎng)綜合鑒定〔5〕。將凍存的實(shí)驗(yàn)菌株接種到Y(jié)PD瓊脂平板培養(yǎng)基（含1%酵母提取物，1%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂，pH為5.6；酵母提取物購自O(shè)XOID，蛋白胨為SLARBIO，葡萄糖及瓊脂購自AMRESCO），35℃培養(yǎng)24 h。取單個菌落再次接種到Y(jié)PD瓊脂平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后取單個菌落接種到5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，置水浴恒溫培養(yǎng)箱中，37℃、160 r/min，過夜培養(yǎng)〔6-7〕即可用于本實(shí)驗(yàn)。
1.2白假絲酵母菌培養(yǎng)及生長測定取經(jīng)YPD培養(yǎng)基兩次激活的菌株，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)，接種到15 mL YPD液體培養(yǎng)基中，使其細(xì)菌終濃度為1×106個/mL。置水浴恒溫培養(yǎng)箱37℃、160 r/min培養(yǎng)。每隔1 h計(jì)數(shù)1次，持續(xù)15 h。白假絲酵母菌在營養(yǎng)較好的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后會出芽，若芽體達(dá)到母細(xì)胞大小的一半時，作為2個菌細(xì)胞計(jì)數(shù)；芽體小于母細(xì)胞一半時為1個菌細(xì)胞。酶標(biāo)儀測定法是在上述時間點(diǎn)，取培養(yǎng)菌液250μL到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用連續(xù)波長酶標(biāo)儀測定菌懸液的OD600〔8-9〕。由于白假絲酵母菌在營養(yǎng)較好的液體培養(yǎng)基中生長速度快，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每次實(shí)驗(yàn)最多只測定6株菌。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，取平均值。
1.3生長曲線的繪制血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法的生長曲線：計(jì)算所有實(shí)驗(yàn)菌株的每一時間測定點(diǎn)的活菌數(shù)的均數(shù)，以培養(yǎng)時間（h）為橫坐標(biāo)，每一時間測定點(diǎn)活菌數(shù)的均數(shù)（×106個/mL）的對數(shù)為縱坐標(biāo)，用EXCEL繪圖。酶標(biāo)儀測定法的生長曲線：計(jì)算所有實(shí)驗(yàn)菌株的每一時間測定點(diǎn)的OD600的均數(shù)，以培養(yǎng)時間（h）為橫坐標(biāo)，每一時間測定點(diǎn)OD600的均數(shù)為縱坐標(biāo)，用EXCEL繪圖。
1.4實(shí)驗(yàn)菌株的代時計(jì)算代時是從生長曲線算出細(xì)胞每分裂一次所需要的時間，參照文獻(xiàn)〔8-9〕進(jìn)行計(jì)算。代時以G表示，其計(jì)算公式為：G=（t2-t1）/〔（1ogN2-logN1）/log2〕，式中t1和t2為所取對數(shù)期兩點(diǎn)的時間；N2和N1分別為相應(yīng)時間測得的菌細(xì)胞數(shù)。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用EXCEL軟件和SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，樣本均數(shù)間比較用方差分析。
2結(jié)果
2.1口腔白假絲酵母菌臨床分離株的生長曲線
用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和酶標(biāo)儀測定法繪制的實(shí)驗(yàn)菌株的生長曲線，兩種方法繪制的108株口腔白假絲酵母菌的生長曲線表現(xiàn)為0～3 h為遲緩期，4～10 h為對數(shù)期，穩(wěn)定期開始于10 h，其中兩種方法測定的遲緩期及對數(shù)生長期基本一致。結(jié)果顯示，HIV感染者和健康人群口腔白假絲酵母菌表現(xiàn)出相似的生長曲線。見圖1-4。
圖1血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法測定1 0 8株白假絲酵母菌臨床分離株生長曲線
圖2血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法測定H I V感染者和健康人群白假絲酵母菌生長曲線
圖3酶標(biāo)儀法測定1 0 8株白假絲酵母菌臨床分離株生長曲線
圖4酶標(biāo)儀法測定H I V感染者和健康人群白假絲酵母菌生長曲線
2.2口腔白假絲酵母菌臨床分離株的代時代時是指菌細(xì)胞分裂數(shù)量倍增所需的時間。參照文獻(xiàn)〔8-9〕計(jì)算得到108株白假絲酵母菌的代時為1.568 h，其中HIV感染者人群白假絲酵母菌代時為1.354 h，健康人群白假絲酵母菌的代時為1.782 h，HIV感染者人群來源的白假絲酵母菌生長速度比健康人群來源的白假絲酵母菌快0.428 h。采用SPSS16.0對HIV感染者口腔白假絲酵母菌和健康人群口腔白假絲酵母菌總體代時均數(shù)進(jìn)行方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.932＞0.05）。
接收部分中，激光經(jīng)過模擬前端后得到中心頻率為22 MHz的中頻信號，模擬前端整體結(jié)構(gòu)如圖1所示，中頻模擬信號經(jīng)過ADC芯片采樣后轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，進(jìn)入軟件接收機(jī)，輸出實(shí)時頻率跟蹤數(shù)據(jù)和基帶信號，并發(fā)送至控制主機(jī)中，最后的跟蹤結(jié)果由FFT估計(jì)的頻率以及數(shù)字基帶信號共同得到。
2.3血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法與酶標(biāo)儀OD600測定法的比較以O(shè)D600值為橫坐標(biāo)，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪出對數(shù)生長期OD600與菌細(xì)胞數(shù)間函數(shù)關(guān)系的回歸曲線，回歸方程為：Y=2.443 7X+1.015 4，決定系數(shù)r=0.936 2，顯著性檢驗(yàn)結(jié)果：F=73.314，P=0.00＜0.01，表明回歸方程差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。通過Spearman秩相關(guān)計(jì)算OD600值和血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的自然對數(shù)的相關(guān)系數(shù)為0.920，經(jīng)秩相關(guān)系數(shù)的統(tǒng)計(jì)推斷P＜0.05，說明血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和酶標(biāo)儀測定法相關(guān)性好。
圖5 OD600與菌細(xì)胞數(shù)的關(guān)系
3討論
大約50%～95%的HIV感染者在發(fā)展為AIDS的過程中以口腔念珠菌病為首發(fā)癥狀，尤其以口腔白假絲酵母菌病最為常見，患者的生存質(zhì)量受到嚴(yán)重的影響，可發(fā)展成食管或全身白假絲酵母菌病，威脅病人生命〔10-12〕。生長曲線是描述微生物生長的一種特殊的曲線，是微生物在培養(yǎng)中所表現(xiàn)出來的生長和繁殖的規(guī)律，不同的菌種可表現(xiàn)出不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長曲線也不同。白假絲酵母菌的群體生長過程主要經(jīng)過4個階段：①遲緩期：此期念珠菌代謝活躍，為分裂繁殖做準(zhǔn)備，但并不繁殖；②對數(shù)期：念珠菌快速繁殖，數(shù)目呈幾何級數(shù)增加；微生物形態(tài)、染色性、生理活性最典型、對抗生素最敏感；③穩(wěn)定期：又稱恒定期或最高生長期，處于穩(wěn)定期的微生物，新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，整個培養(yǎng)物中二者處于動態(tài)平衡，此時生長速度，逐漸趨向零；④衰亡期：活的白假絲酵母菌總數(shù)下降，代謝逐漸停滯。白假絲酵母菌的生長速度與致病相關(guān)，當(dāng)白假絲酵母菌的生長速度小于口腔的清理速度時，清理起主要作用；白假絲酵母菌的生長速度和口腔的清理速度相近時，就會有菌落形成；若白假絲酵母菌的生長速度大于口腔的清理作用時，就會出現(xiàn)組織的損傷，導(dǎo)致口腔白假絲酵母菌病〔11-14〕。由一個細(xì)胞分裂成為兩個細(xì)胞的時間間隔稱為世代，一個世代所需的時間就是代時。Thewes等〔6〕通過測定OD600繪制了在YPD液體培養(yǎng)基中的兩個標(biāo)準(zhǔn)株SC5314和ATCC10231的生長曲線，發(fā)現(xiàn)生長率對不同白假絲酵母菌株的致病性有一定的影響，毒性和侵入性都較強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)株SC5314比ATCC10231世代時間稍短。本研究測得的HIV感染者口腔白假絲酵母菌生長速度比健康人群平均快0.428 h，前者代時相對較短，生長較快，可能與致病有關(guān)，但目前國內(nèi)外尚未見類似報道。
目前測定真菌生長曲線的方法很多，有平板稀釋法、血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法、染色法、濁度法、菌體干重法等。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可計(jì)數(shù)活細(xì)胞，但耗時長，操作步驟繁瑣，工作量大。在本研究中，我們同時用酶標(biāo)儀測定白假絲酵母菌菌液的OD600值，結(jié)果與血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)用酶標(biāo)儀法和活菌計(jì)數(shù)法所測出的口腔白假絲酵母菌生長曲線趨勢基本一致，兩種方法的結(jié)果在對數(shù)期有很好的相關(guān)性，而進(jìn)入穩(wěn)定期后由于死菌數(shù)的增加，酶標(biāo)儀法無法區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，導(dǎo)致酶標(biāo)儀法測定的生長曲線的平臺期與活菌計(jì)數(shù)法有所不同。但酶標(biāo)儀測定法具有菌液用量少、快速、靈敏、操作簡單、重復(fù)性好的特點(diǎn)，而且根據(jù)OD600值繪得的生長曲線在一定程度上是可以反映白假絲酵母菌總的生長趨勢，因此在嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件下，在對數(shù)生長期可以使用測定培養(yǎng)液的OD600值來推算菌細(xì)胞數(shù)代替菌細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，也可以根據(jù)OD600值作為判斷白假絲酵母菌生長是否進(jìn)入對數(shù)生長期。
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