雙歧桿菌分離鑒定、耐受性試驗(yàn)、益生特性試驗(yàn)及安全性評(píng)價(jià)（二）
1.3.2膽鹽耐受能力試驗(yàn)
將上述供試菌懸液按照2%（v/v）的接種量接種于膽鹽濃度0.3%的MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，使用Biosense自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析系統(tǒng)于600 nm處測(cè)定A值。選取生長(zhǎng)12 h后菌體密度增長(zhǎng)較大的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
1.3.3模擬人工胃腸液試驗(yàn)
選擇耐受性較好的雙歧桿菌菌株，按照上述試驗(yàn)方法制成供試菌懸液，人工胃液、人工腸液配置及實(shí)驗(yàn)方法參照Liu等所用方法進(jìn)行，計(jì)算存活率。胃液存活率（%）=N1/N0×100%，腸液存活率（%）=N2/N1×100%，式中：N0表示0 h的活菌數(shù)（CFU/mL），N1表示在胃液中培養(yǎng)3 h的活菌數(shù)（CFU/mL），N2表示在腸液中培養(yǎng)4、8 h的活菌數(shù)（CFU/mL）。
1.3.4表面疏水性測(cè)定
采用碳?xì)湮椒?，?duì)菌株的表面疏水性進(jìn)行測(cè)定，培養(yǎng)至3代的菌液以3 505×g離心5 min后棄上清液，無(wú)菌PBS緩沖溶液洗滌2次后重懸，調(diào)整菌懸液濃度使其在600 nm處的A值為1.0，菌懸液加入等體積二甲苯，震蕩使其充分混勻，靜置60 min使之分層，于600 nm處測(cè)得下層A1值，計(jì)算菌株疏水性。菌株疏水性（%）=（1?A1/A0）×100%，式中：A0為初始吸光度，A1為處理后吸光度。
1.3.5菌株表面自聚集能力測(cè)定
對(duì)菌株進(jìn)行表面自聚集能力測(cè)定，按1.3.4所述方法制備菌懸液，37℃厭氧培養(yǎng)，于0、2、4、6、8、12、24 h分別測(cè)定菌懸液上層在600 nm處的A值，計(jì)算菌株自聚集能力。菌株自聚集能力（%）=（1?At/A0）×100%，式中：A0為初始吸光度，At為t時(shí)間吸光度。
1.3.6抑菌能力測(cè)定
選取大腸埃希菌等4種致病菌作為指示菌，使用牛津杯法檢測(cè)雙歧桿菌對(duì)致病菌的抑菌能力，觀察抑菌圈，直至抑菌圈清晰停止培養(yǎng)，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。
1.4安全性評(píng)價(jià)
1.4.1抗生素耐藥性測(cè)定
使用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定雙歧桿菌對(duì)20種抗生素的敏感性，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。
1.4.2溶血試驗(yàn)
將活化后菌株劃線于體積分?jǐn)?shù)6%的脫纖維綿羊血固體平板上，37℃培養(yǎng)48 h，并進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照（金黃色葡萄球菌），記錄菌株生長(zhǎng)情況。
1.4.3菌株全基因組測(cè)序和注釋
將菌株于MRS液體培養(yǎng)基中活化并傳代培養(yǎng)，按1.2.1所述方法收集菌體細(xì)胞，經(jīng)液氮極冷后送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，使用SOAP denovo v 2.0軟件對(duì)高質(zhì)量reads進(jìn)行組裝，以基因組大小、Saffold數(shù)量、GC含量作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，采用CapCloser軟件對(duì)內(nèi)部Gap進(jìn)行填充和單堿基校正，完成組裝?；诙玖驍?shù)據(jù)庫(kù)（VFDB）對(duì)菌株FYF41-14蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)置參數(shù)閾值為相似度＞85%、E值＜1e-15、序列匹配長(zhǎng)度＞300 bp。基于綜合抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)（CARD）對(duì)菌株FYF41-14蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)置參數(shù)閾值為相似度＞85%、E值＜1e-15、序列匹配長(zhǎng)度＞300 bp。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行顯著性分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本以上數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
2.結(jié)果
2.1雙歧桿菌分離鑒定
對(duì)樣本進(jìn)行分離純化后，獲得239株疑似雙歧桿菌，菌落形態(tài)呈現(xiàn)邊緣整齊、表面光滑或粗糙3種形態(tài)，顏色多為白色、乳白色或淡黃色的圓形菌落，且239株菌均為革蘭陽(yáng)性菌。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌體細(xì)胞多數(shù)呈現(xiàn)V型或Y型桿狀。
利用DNA提取試劑盒提取雙歧桿菌基因組DNA，利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度和純度的檢測(cè)，結(jié)果顯示所有菌株DNA濃度均在100～3 000 ng/L，純度（A260/A280）均在1.8～2.0，表明菌株DNA提取成功。進(jìn)一步對(duì)檢測(cè)合格的DNA片段采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有菌株在1 500 bp處均有明亮清晰的條帶，且無(wú)拖尾現(xiàn)象。綜上表明分離株16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足后續(xù)的測(cè)序和分析要求。
測(cè)序得到菌株序列，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有數(shù)據(jù)對(duì)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，將同源性大于99%的菌株與同一種水平的模式株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，部分菌株的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果如圖1所示，239株菌株均鑒定為雙歧桿菌。
圖1雙歧桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
鑒定結(jié)果如圖2A所示，其中數(shù)量最多為長(zhǎng)雙歧桿菌（57.32%），其次為假小鏈雙歧桿菌（17.99%），齒雙歧桿菌數(shù)量最少（0.42%）。兒童樣本共計(jì)分離到107株，隸屬6個(gè)種，優(yōu)勢(shì)菌種為長(zhǎng)雙歧桿菌（56.07%）。成人樣本中分離得到132株，包括5個(gè)種，優(yōu)勢(shì)菌種為長(zhǎng)雙歧桿菌（58.33%）。值得關(guān)注的是，短雙歧桿菌、齒雙歧桿菌僅在兒童樣本中存在，兩歧雙歧桿菌僅在成人樣本中存在。
圖2雙歧桿菌分離鑒定情況
注：A為不同年齡段樣本雙歧桿菌分離鑒定結(jié)果；B為不同培養(yǎng)基雙歧桿菌分離情況。
分析不同培養(yǎng)基對(duì)可培養(yǎng)物種豐富度的影響，結(jié)果如圖2B所示，我們發(fā)現(xiàn)MRSC共計(jì)分離到100株（41.84%），BHI為43株（17.99%），其余培養(yǎng)基為MRS（17.15%）、LRIM（12.13%）、LBS（8.79%）、RCM（2.09%），LF、LA中未分離得到雙歧桿菌，MRSC、BHI兩種培養(yǎng)基的雙歧桿菌分離率和分離物種豐富度均較高，MRSC可分離到7個(gè)種的雙歧桿菌，BHI可分離到5個(gè)種。
相關(guān)新聞推薦
1、雙歧桿菌分離鑒定、耐受性試驗(yàn)、益生特性試驗(yàn)及安全性評(píng)價(jià)（一）
2、紅曲霉發(fā)酵方法、生長(zhǎng)曲線及工藝優(yōu)化
3、苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞凋亡、抑制活性、DNA的影響（二）
4、蒼鷺養(yǎng)殖如何控制沙門菌病？用什么藥好【藥敏試驗(yàn)二】
5、優(yōu)化培養(yǎng)基配方減少無(wú)機(jī)硒對(duì)粗毛纖孔菌的抑制作用，同時(shí)提高富硒菌絲的產(chǎn)量（三）