苯乳酸對霍氏腸桿菌生長曲線、細(xì)胞凋亡、抑制活性、DNA的影響（二）
1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測 分別取28 ℃和37 ℃培養(yǎng)的霍氏腸桿菌菌懸液，于4 000 r/min 離心10 min，收集菌體。將菌體用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次，重復(fù)上述離心，收集菌體，再用PBS 稀釋，使菌懸液OD595nm ≈0.5。將苯乳酸添加到菌懸液 中，使其終 質(zhì)量濃度為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC，以未添加苯乳酸的菌液未對照組，分別于28℃和37 ℃振蕩培養(yǎng)（160 r/min）24 h。取一定量的培養(yǎng)液離心收集菌體，將菌體用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次后，使用1 mL PI 染液染色并混合均勻，在4 ℃下避光靜置30 min 后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。
1.3.5 堿性磷酸酶（AKP）的測定 取一定量在28℃培養(yǎng)的霍氏腸桿菌懸液，于4 000 r/min 離心10 min，收集菌體。將菌體用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次，重復(fù)上述離心，收集菌體，再用PBS 稀釋，使菌懸液OD595nm ≈0.5。將苯乳酸添加到菌懸液 中，使其終 質(zhì)量濃度為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC，置于28 ℃振蕩培養(yǎng)（160 r/min）。分別于24 h 和48 h 取一定量的培養(yǎng)液離心收集菌體，將菌體用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次后，用超聲破碎儀破碎菌體，使用堿性磷酸酶（AKP）試劑盒測定菌體AKP 含量。
1.3.6 細(xì)胞膜完整性的測定 前處理參考1.3.5節(jié)方法，置于28 ℃振蕩培養(yǎng)（160 r/min）24 h。取一定量的培養(yǎng)液離心收集菌體，將菌體用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次后，使用250 μL 二乙酸熒光素-丙酮溶液（2 mg/mL）進(jìn)行染色后靜置15 min，用PBS 清洗并重懸后，在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為297 nm 和527 nm 時，使用熒光分光光度計(jì)測定平均熒光強(qiáng)度。
1.3.7 核酸泄漏的測定 前處理參考1.3.5 節(jié)方法，置于28 ℃振蕩培養(yǎng)（160 r/min）24 h 和48 h，離心收集上清液用紫外分光光度計(jì)在260 nm 下測定OD 值。
1.3.8 蛋白質(zhì)泄漏的測定 前處理參考1.3.5 節(jié)方法，置于28 ℃振蕩培養(yǎng)（160 r/min）24 h 和48 h，離心收集上清液用紫外分光光度計(jì)在280 nm下測定OD 值。
1.3.9 核酸凝膠電泳 前處理參考1.3.5 節(jié)方法，置于28 ℃振蕩培養(yǎng)（160 r/min）24 h。使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，進(jìn)行DNA 瓊脂糖凝膠電泳（100 V、60 min），凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。
1.3.10 運(yùn)動能力的測定 為測定霍氏腸桿菌的運(yùn)動能力，配制群集瓊脂培養(yǎng)基（10 g/L 蛋白胨、5 g/L 氯化鈉、5 g/L 瓊脂和5 g/L 果糖），并將苯乳酸溶于培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC，取2 μL 菌懸液接種于群集瓊脂平板表面中心處，在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h。測定細(xì)菌擴(kuò)散圈的直徑。
1.3.11 生物被膜形成量測定 取1 mL 含不同質(zhì)量濃度苯乳酸（0、1/2 MIC、MIC、2 MIC）的菌懸液至1.5 mL 離心管中，混勻后在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)48 h 和72 h。棄掉液體培養(yǎng)基，0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次，無菌風(fēng)干燥30 min，加入1 g/L 結(jié)晶紫溶液染色15 min，PBS 清洗2 次，最后，使用33%冰乙酸溶解附著在生物膜上的結(jié)晶紫，用酶標(biāo)儀測定OD595nm 處的吸光度。
1.3.12 激光共聚焦顯微鏡觀察 取1 mL 含不同質(zhì)量濃度苯乳酸（0、1/2 MIC、MIC、2 MIC）的菌懸液至無菌共聚焦玻底培養(yǎng)皿中，混勻后在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)72 h。棄掉液體培養(yǎng)基，0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次，無菌風(fēng)干燥30 min，用1 mL 2.5%的戊二醛4 ℃下固定30 min，用1 mL 0.1 mg/mL 的AO 染色液室溫避光條件下染色30 min，吸出染料，PBS 沖洗后待其表面干燥，加入1 滴抗熒光淬滅封片劑。使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察（激發(fā)波長488 nm，阻斷濾光片波長515 nm）。
1.3.13 分子對接 從Protein Data Bank（http：//www.rcsb.org/）下 載DNA 的三級結(jié)構(gòu)（ID：3CLC），在對接前對DNA 和苯乳酸進(jìn)行前處理，使用工具AutoGrid4，AutoDock4 和MGL tool1.5.6進(jìn)行苯乳酸和DNA 相互作用的分子對接，最后使用PyMol 對結(jié)果渲染并輸出。
1.3.14 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)為重復(fù)3 次的平均值，采用SPSS 18.0 進(jìn)行ANOVA 分析，P ＜0.05 為差異顯著。采用Excel 和Origin 2019b 軟件處理數(shù)據(jù)和繪制圖表。
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