高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用
L-高絲氨酸(Homoserine，2-Amino-4-hydroxybutyricacid)，是一種非蛋白氨基酸?？捎糜诘鞍彼?、蘇氨酸、胱硫醚、L-高絲氨酸內(nèi)酯、γ-丁內(nèi)酯、1,4-丁二醇、O-乙酰高絲氨酸與手性除草劑L-草胺膦等化學(xué)物質(zhì)的生產(chǎn)，是一種極具潛力的中間體。L-高絲氨酸及其衍生物具有豐富的的生物活性，例如可提高植物的抗逆性，促進(jìn)家禽生長(zhǎng)，還可以有效地抑制鐮狀紅細(xì)胞、并作為抗真菌藥物，當(dāng)前L-高絲氨酸的生產(chǎn)方法包括化學(xué)合成法、化學(xué)手性拆分法和生物法。
目前，化學(xué)合成法、化學(xué)手性拆分法和生物法來(lái)生產(chǎn)L-高絲氨酸，其中化學(xué)合成法使用的原料比較容易獲得，收率較高，但是提純步驟較為復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，而化學(xué)手性拆分法指在混旋的高絲氨酸溶液中，加入手性試劑進(jìn)行反應(yīng)，使L/D-高絲氨酸性質(zhì)發(fā)生差異，從而分離出L-高絲氨酸。該方法產(chǎn)率較低，由于在該過(guò)程中加入了大量的有機(jī)溶劑，因此會(huì)產(chǎn)生較大的污染，上述兩種生產(chǎn)制備L-高絲氨酸的方式都存在較大弊端，隨著微生物代謝工程的快速發(fā)展，在氨基酸工業(yè)生產(chǎn)中涌現(xiàn)大量以葡萄糖為原料的生產(chǎn)菌株，通過(guò)通過(guò)調(diào)控分支途徑、不斷優(yōu)化合成代謝流、調(diào)節(jié)輔因子水平，以提高無(wú)質(zhì)粒、非營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株產(chǎn)量，但是通過(guò)生物方式生產(chǎn)L-高絲氨酸所采用的大腸桿菌Escherichia coli dh5aα由于在發(fā)酵中容易導(dǎo)致乙酰輔酶A的積累，使得檸檬酸循環(huán)的物質(zhì)輸入減少，且對(duì)乙酰輔酶A的利用能力較低，最終導(dǎo)致發(fā)酵生產(chǎn)的L-高絲氨酸的產(chǎn)量較低。
因此，為了解決上述技術(shù)問題本申請(qǐng)?zhí)岢鲆环N高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
一種高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法操作步驟：
A：構(gòu)建基因工程菌大腸桿菌，得到高產(chǎn)菌株Escherichia coli dh5aα，其具體的構(gòu)建步驟為；
A1：使用菌株CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除了旁路代謝的相關(guān)基因(metB、thrB、metA、lysA)和調(diào)節(jié)基因(metJ)；
A2：將metL基因的天然啟動(dòng)子替換為Trc啟動(dòng)子，并且敲除轉(zhuǎn)運(yùn)基因metI構(gòu)建得到了高產(chǎn)菌株Escherichia coli dh5aα；，
B：通過(guò)將ppc基因(編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的天然啟動(dòng)子替換為Trc啟動(dòng)子，再通過(guò)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)了突變基因pyccg P458S(pyc*)，基因ppc和pyc*分別編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶，這兩種酶可以減少乙酰輔酶A積累，增加檸檬酸循環(huán)的物質(zhì)輸入；
通過(guò)過(guò)表達(dá)thrAC1034T(thrA*)和lysCcg C932T(lysC*)基因，thrA*編碼抗反饋抑制的天冬氨酸激酶Ⅲ和高絲氨酸脫氫酶Ⅰ融合蛋白，lysC*編碼抗反饋抑制的天冬氨酸激酶Ⅰ，thrA*和lysC*的過(guò)表達(dá)將提高產(chǎn)物的合成速率，能減少草酰乙酸、檸檬酸等副產(chǎn)物的積累；
C：敲除乙醛酸途徑轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因iclR來(lái)強(qiáng)化乙醛酸循環(huán)，從而來(lái)強(qiáng)化菌株對(duì)乙酰輔酶A的利用能力，隨后外源導(dǎo)入了蔗糖代謝基因，提高高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌利用蔗糖的發(fā)酵能力，通過(guò)以上步驟，得到高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株；
需要說(shuō)明的是，根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株發(fā)酵L-高絲氨酸的應(yīng)用具有如下步驟；
D：對(duì)高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株進(jìn)行菌種活化以及培養(yǎng)種子液，并將培養(yǎng)好的種子液以體積濃度5％的接種量接種至5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基上；
E：將活化完成后的高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃、200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)，將培養(yǎng)液分離純化，獲得L-高絲氨酸，并且為了在發(fā)酵過(guò)程中防止菌體污染，在培養(yǎng)基中添加了少量抗生素，并且為了提高L-高絲氨酸工程菌的生產(chǎn)性能，可通過(guò)加強(qiáng)更短、轉(zhuǎn)化率更高的合成路徑、優(yōu)化中心代謝途徑、調(diào)節(jié)輔因子水平、加快菌株生長(zhǎng)等策略實(shí)現(xiàn)，其中需要說(shuō)明的是，為了保障高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株的活性，在進(jìn)行種子培養(yǎng)時(shí)，需將高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株暫存于-80℃的環(huán)境中；
通過(guò)以上步驟，使用經(jīng)過(guò)改造后的重組大腸桿菌相比于野生型能夠更好地利用葡萄糖等碳源物質(zhì)進(jìn)行L-高絲氨酸的生產(chǎn)，并且能力更強(qiáng)，轉(zhuǎn)化率更高；請(qǐng)參閱圖2所示，經(jīng)過(guò)改造后得到的性能最優(yōu)的菌株在發(fā)酵生產(chǎn)L-高絲氨酸方面的水平相比于野生型有明顯提升，5L罐發(fā)酵水平從32.17g/L提升至60.87g/L，產(chǎn)率提高了89.21％，并且由工程菌dh5aα的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線可知，在發(fā)酵32h后L-高絲氨酸產(chǎn)量最大，發(fā)酵產(chǎn)生的L-高絲氨酸的產(chǎn)量相較于通常情況下，生產(chǎn)效率更高，具有良好的應(yīng)用推廣價(jià)值；
在該方案的其中一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株進(jìn)行菌種活化和種子液的培養(yǎng)方法分為如下步驟進(jìn)行；
D1：將高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株接種在LB固體培養(yǎng)基平板上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，實(shí)現(xiàn)對(duì)高產(chǎn)L-高絲氨酸的重組大腸桿菌菌株的活化操作，其中LB固體培養(yǎng)基平板的具體結(jié)構(gòu)成分為蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L，溶劑為去離子水，pH值自然。LB平板是在LB液體培養(yǎng)基中添加終濃度2g/L瓊脂；
D2：挑取LB平板上長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm的搖床中培養(yǎng)24h，獲得種子液；
其中，所述5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基的具體物質(zhì)組成包括葡萄糖40g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸銨17g/L、酵母粉4g/L、碳酸鈣20g/L、L-蘇氨酸0.20g/L、L-蛋氨酸0.2g/L、維生素B1 0.0001g/L、維生素B1 20.000g/L、L-異亮氨酸0.2g/L、MgSO4 2g/L、FeSO4 0.005g/L、MnSO4 0.005g/L、ZnSO4 0.005g/L，去離子水1000mL，pH值為6.8，將適量經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后的菌體細(xì)胞接種至裝有2.5L種子培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐，流加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH 6.8～7.2，溶氧維持20％～40％，通風(fēng)量2～4m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速200～800r/min，35℃培養(yǎng)6h。以10％接種量將種子培養(yǎng)物接至裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度35℃，通風(fēng)量2～4m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速300～900r/min，溶氧維持在20％～50％，流加80％的葡萄糖溶液，維持殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為1～3g/L，流加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH6.8～7.2，發(fā)酵周期52h。利用H-10發(fā)酵時(shí)，接種后加入終濃度為0.05mmol/L的IPTG；
在發(fā)酵完成后，通過(guò)生物傳感器分析儀測(cè)定葡萄糖含量。生物量以O(shè)D600nm計(jì)。采用高效液相色譜柱前衍生法測(cè)定L-高絲氨酸濃度。樣品用2,4-二硝基氟苯衍生，以乙腈-水混合液(1∶1，V/V)和50mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，以1mL/min的流速梯度混合經(jīng)過(guò)C18AAA色譜柱分離，最后在360nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)。
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