枯草芽孢桿菌JN005胞外抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌生長抑制作用研究（三）
2.3光學顯微鏡下觀察JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)影響稻瘟病菌菌絲形態(tài)和孢子萌發(fā)
在光學顯微鏡下觀察稻瘟病菌菌絲，發(fā)現(xiàn)無菌水和PBS緩沖液的對照組稻瘟病菌菌絲生長正常，菌絲呈條狀且筆直。加入胞外抗菌物質(zhì)粗提液的處理組稻瘟病菌菌絲生長異常：稀釋100倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的菌絲出現(xiàn)腫脹、變形和扭曲，稀釋50倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的菌絲斷裂、分節(jié)，稀釋20倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的菌絲頂端逐漸呈球狀膨大，胞外抗菌物質(zhì)粗提液原液處理的菌絲頂端破裂，原生質(zhì)發(fā)生滲漏。
圖4 JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌菌絲生長的影響A為無菌水處理，B為PBS緩沖液處理，C~F為胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理。
表1 JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液對葉瘟的防效(離體接種)
| 處理 Treatment | 稀釋倍數(shù) Dilution ratio | 試驗組A Test group A 發(fā)病率 Disease incidence/% | 試驗組B Test group B 發(fā)病率 Disease incidence/% |
|---|---|---|---|
| 清水 Water | 0 | 98.5±0.7 a | 97.8±1.3 a |
| PBS緩沖液 PBS buffer | 0 | 97.0±2.0 a | 99.3±0.7 a |
| 40%稻瘟靈乳油 40% isoprothiolane (EC) | 500 | 30.4±3.0 b | 29.6±2.7 c |
| 75%三環(huán)唑可濕性粉劑 75% tricyclazole (WP) | 1500 | 20.0±1.3 c | 23.0±1.5 d |
| 胞外抗菌物質(zhì)粗提液 Extracellular antimicrobial substances crude extract | 100 | 34.1±3.2 b | 38.5±2.7 b |
在光學顯微鏡下觀察稻瘟病菌孢子，當對照組無菌水和PBS緩沖液處理的稻瘟病菌孢子正常萌發(fā)時，胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的稻瘟病菌孢子發(fā)生異常：稀釋100倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的孢子能夠萌發(fā)，芽管伸長，但其附著孢膨大；稀釋50倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的孢子萌發(fā)受阻，芽管短，其附著孢變大，稀釋20倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的孢子一端呈球型脹大，胞外抗菌物質(zhì)粗提液原液處理的孢子變形，孢子兩端呈球型變大。
圖5 JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌孢子的影響A為無菌水處理；B為PBS緩沖液處理，C~F為胞外抗菌物質(zhì)粗提液。
2.4 JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)對葉瘟的防治效果
室內(nèi)湘晚秈12號稻瘟病離體葉片接種表明，試驗組A中，對稻瘟病效果最為顯著的是1500倍75%三環(huán)唑(WP)稀釋液，發(fā)病率為20.0%；而100倍胞外抗菌物質(zhì)稀釋液的葉瘟發(fā)病率為34.1%，較接近發(fā)病率為30.4%的500倍40%稻瘟靈(EC)稀釋液。試驗組B中，稀釋1500倍的75%三環(huán)唑(WP)發(fā)病率為23.0%，稀釋500倍的40%稻瘟靈(EC)發(fā)病率為29.6%，稀釋100倍的胞外抗菌物質(zhì)發(fā)病率為38.5%，三者差異顯著。根據(jù)圖6，發(fā)現(xiàn)先進行胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理后接種的葉片防稻瘟病效果整體高于先接種后進行胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的效果，說明提前施用JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液有利于水稻葉片對葉瘟的防治。
圖6 JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)對葉瘟的防治效果(離體接種)A為清水處理；B為胞外抗菌物質(zhì)處理。
表2 JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液對葉瘟的防效(活體接種)
| 處理 Treatment | 稀釋倍數(shù) Dilution ratio | 試驗組C Test group C | 試驗組D Test group D | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 發(fā)病率 Disease incidence/% | 病情指數(shù) Disease index | 防治效果 Control efficicy/% | 發(fā)病率 Disease incidence/% | 病情指數(shù) Disease index | 防治效果 Control efficicy/% | ||
| 清水 Water | 0 | 97.8±1.1 a | 82.1±0.9 a | / | 96.7±1.9 a | 80.3±0.9 a | / |
| PBS緩沖液 PBS buffer | 0 | 94.4±1.1 a | 80.3±0.7 a | 2.2±0.9 d | 95.6±2.9 a | 79.3±0.6 a | 1.2±0.5 c |
| 40%稻瘟靈乳油 40% isoprothiolane (EC) | 500 | 35.6±2.9 b | 15.1±0.4 c | 81.7±0.5 b | 37.8±2.9 b | 13.7±0.7 c | 83.0±0.9 a |
| 75%三環(huán)唑可濕性粉劑 75% tricyclazole (WP) | 1500 | 25.6±2.9 c | 11.3±0.7 d | 86.3±0.7 a | 27.8±1.1 c | 12.5±0.8 c | 84.4±1.1 a |
| 胞外抗菌物質(zhì)粗提液 Crude extracts of extracellular antimicrobial substances | 100 | 40.0±3.3 b | 20.3±1.6 b | 75.3±1.8 c | 43.3±3.9 b | 22.9±0.9 b | 71.5±1.1 b |
活體噴霧接種試驗表明，雖然100倍胞外抗菌物質(zhì)稀釋液在試驗組C中防效為75.3%，試驗組D中防效為71.5%，但都比不上1500倍75%三環(huán)唑(WP)稀釋液和500倍40%稻瘟靈(EC)稀釋液。各結(jié)果相比，先噴施胞外抗菌物質(zhì)粗提液后接種的水稻防治葉瘟效果比先接種后噴施胞外抗菌物質(zhì)粗提液效果好，由此得出JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液對水稻葉片具有保護作用。
圖7胞外抗菌物質(zhì)對葉瘟的防效(活體接種)A為清水處理；B為胞外抗菌物質(zhì)處理。
3討論
芽孢桿菌生物防治劑一直在植物病害綜合管理中扮演著非常重要的角色。許多學者描述了枯草芽孢桿菌產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、蛋白、脂肽等代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)具有拮抗立枯絲核菌、灰霉病菌、黑條葉斑病菌等植物病原物生長的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌JN005能夠產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和β-1，3-葡聚糖酶，并且JN005菌株的胞外抗菌物質(zhì)在平板上對稻瘟病菌有較好的拮抗活性。
在提取JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)的過程中，探究了其物理和化學特性。Wang等報道枯草芽孢桿菌E1R-J的抗菌蛋白EP-2在40℃~100℃下孵育30 min后均可檢測到抗蘋果樹腐爛病菌活性，且拮抗效果僅下降14.9%；同樣，本研究的枯草芽孢桿菌JN005胞外抗菌物質(zhì)在0℃~100℃范圍內(nèi)抗稻瘟病菌的抑菌直徑未有大幅度變化，具有熱穩(wěn)定性。鄭小亮等測試枯草芽孢桿菌Zl-2抗菌蛋白酸堿穩(wěn)定性，結(jié)果顯示過酸、過堿都會影響抗小麥赤霉病菌效果；而枯草芽孢桿菌JN005胞外抗菌物質(zhì)在pH 2~11范圍內(nèi)均表現(xiàn)出對稻瘟病菌有抑菌活性，但對pH為12處理最敏感。黃華毅等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌STO-12脂肽類物質(zhì)分別與多種蛋白酶混合和紫外線照射其抑菌活性沒有明顯減弱；反觀枯草芽孢桿菌JN005胞外抗菌物質(zhì)只有經(jīng)蛋白酶K處理后才保持其原有的抗菌效果，且紫外照射時間越長抑菌活性有所降低。張曉云等的枯草芽孢桿菌CAB-1蛋白粗提物在4℃條件下儲存120 d后抑制番茄灰霉菌活性變化不大，枯草芽孢桿菌JN005胞外抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌也有相同的性質(zhì)。
在枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)影響植物病原菌孢子萌發(fā)和菌絲形態(tài)方面，劉燕等報道枯草芽孢桿菌SL13抗菌幾丁質(zhì)酶使得立枯絲核菌菌絲細胞壁解體、原生質(zhì)外泄、菌絲體破裂；吳艷清等用顯微鏡觀察到枯草芽孢桿菌WL2脂肽粗提物能夠抑制致病疫霉孢子萌發(fā)；本研究的枯草芽孢桿菌JN005胞外抗菌物質(zhì)令稻瘟病菌菌絲和孢子都生長異常，且還能阻礙孢子萌發(fā)和附著孢形成，這可能會降低稻瘟病在水稻葉片上發(fā)生的幾率。
黃娜等的枯草芽孢桿菌胞外粗提蛋白防治蘋果炭疽病室內(nèi)活體試驗表明，先蛋白處理后接種試驗中，不稀釋的胞外蛋白的防效可達100%，在先接種后蛋白處理的試驗中，胞外蛋白的防效為55%。對于枯草芽孢桿菌JN005胞外抗菌物質(zhì)防治水稻葉瘟而言，不論是離體還是活體接種試驗，提前施用胞外抗菌物質(zhì)能提高防治效果，可見胞外抗菌物質(zhì)一定程度上影響了葉瘟的發(fā)生，起到了保護水稻葉片的作用。稻瘟靈和三環(huán)唑是對抗稻瘟病最常用的兩種化學藥劑，而接種實驗中，稀釋100倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液效果比較接近40%稻瘟靈(EC)，不如75%三環(huán)唑(WP)?？莶菅挎邨U菌在農(nóng)業(yè)方面研究得十分廣泛，也被美國食品和藥物管理局認定為"公認安全"的微生物。考慮到枯草芽孢桿菌JN005胞外抗菌物質(zhì)的實用性，將其純化鑒定后的物質(zhì)作為防治稻瘟病的生物防治劑，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展是非常有潛力的。
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