枯草芽孢桿菌JN005胞外抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌生長抑制作用研究（二）
1.3 JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性
將胞外抗菌物質(zhì)粗提液分別置于0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃下恒溫處理30 min后，冷卻至室溫，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性。
將胞外抗菌物質(zhì)粗提液分別用1 mol/L鹽酸和1 mol/L氫氧化鈉溶液將其pH調(diào)至2~12，置于4℃下靜置24 h后pH調(diào)回中性，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性。
在胞外抗菌物質(zhì)粗提液中分別加入等體積的1 mg/mL木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶K、鏈蛋白酶，充分混勻后常溫下靜置1 h，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性。
將胞外抗菌物質(zhì)粗提液置于距離28 W紫外燈光的10 cm處，分別照射15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h和12 h，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性。
將胞外抗菌物質(zhì)粗提液置于4℃下保存，每隔10 d進(jìn)行檢測，持續(xù)檢測120 d，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性。
1.4 JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響
將胞外抗菌物質(zhì)粗提液(濃度為1.54 mg/mL)用無菌水分別稀釋20倍、50倍和100倍，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第3天將蓋玻片插入稻瘟病菌菌餅和加樣孔之間的培養(yǎng)基中，相同條件繼續(xù)培養(yǎng)，待菌絲長至蓋玻片上時取出，制成玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，設(shè)胞外抗菌物質(zhì)粗提液原液、PBS緩沖液和無菌水的處理作對照。
將胞外抗菌物質(zhì)粗提液(濃度為1.54 mg/mL)用無菌水分別稀釋20倍、50倍和100倍，吸取3個濃度的液體各500μL與稻瘟病菌分生孢子懸浮液(1×105個/mL)等量混合均勻，再吸取各混合液分別滴100μL于載玻片上，將載玻片架放于帶有淺層無菌水的培養(yǎng)皿中于28℃恒溫培養(yǎng)箱中加蓋保濕培養(yǎng)，每處理3個重復(fù)，設(shè)胞外抗菌物質(zhì)粗提液原液、PBS緩沖液和無菌水的處理作對照，當(dāng)無菌水處理的對照孢子萌發(fā)率達(dá)到90%以上時，觀察各處理孢子萌發(fā)情況。
1.5 JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)對葉瘟的防治
將胞外抗菌物質(zhì)粗提液(濃度為1.54 mg/mL)用無菌水稀釋100倍，40%稻瘟靈(EC)用無菌水稀釋500倍，75%三環(huán)唑(WP)用無菌水稀釋1500倍。湘晚秈12號盆栽種植，于5葉1心時，取添加適量吐溫的稻瘟病菌分生孢子液(1×105個/mL)，參照《水稻稻瘟病抗性室內(nèi)離體葉片鑒定技術(shù)規(guī)程》進(jìn)行離體葉片接種，即用昆蟲針對離體葉片正面制造3個微創(chuàng)傷點，在微創(chuàng)傷點上接種稻瘟病菌孢子懸浮液。接種后的培養(yǎng)皿置于28℃、相對濕度100%環(huán)境下，黑暗處理24 h后，再按光照和黑暗正常周期交替培養(yǎng)，直至水稻葉片發(fā)稻瘟病。具體分為A、B兩個處理，根據(jù)清水對照處理的發(fā)病情況，計算發(fā)病率。
試驗組A：離體葉片分別用胞外抗菌物質(zhì)稀釋液、40%稻瘟靈(EC)稀釋液、75%三環(huán)唑(WP)稀釋液、PBS緩沖液和清水浸濕5 min并晾干，24 h后接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液。試驗組B：離體葉片接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液，24 h后分別用胞外抗菌物質(zhì)稀釋液、40%稻瘟靈(EC)稀釋液、75%三環(huán)唑(WP)稀釋液、PBS緩沖液和清水浸濕5 min并晾干。
若病斑僅局限于葉片劃傷處，呈褐色點狀，病斑中無分生孢子形成，記為未發(fā)病；若病斑呈梭形，中央灰色的崩潰部生有菌絲和分生孢子，崩潰部的外圍可能有褐色壞死，最外層是淡黃色的中毒部，形狀不規(guī)則，邊緣呈現(xiàn)出暗綠色記為發(fā)病。
發(fā)病率(%)=(發(fā)病病斑數(shù)/調(diào)查總病斑數(shù))×100。
將胞外抗菌物質(zhì)粗提液(濃度為1.54 mg/mL)用無菌水稀釋100倍，40%稻瘟靈(EC)用無菌水稀釋500倍，75%三環(huán)唑(WP)用無菌水稀釋1500倍。把長至3葉1心的湘晚秈12號秧苗盆栽移至溫室內(nèi)，取添加適量吐溫的稻瘟病菌分生孢子液(1×105個/mL)均勻噴霧在葉片上，置于28℃、相對濕度100%環(huán)境下，黑暗處理24 h后，再按光照和黑暗正常周期交替培養(yǎng)，直至葉片發(fā)稻瘟病。具體分為C、D兩個處理，根據(jù)清水對照處理的發(fā)病情況，調(diào)查發(fā)病率和病級，計算病情指數(shù)和防治效果。
試驗組C：先分別噴施胞外抗菌物質(zhì)稀釋液、40%稻瘟靈(EC)稀釋液、75%三環(huán)唑(WP)稀釋液、PBS緩沖液和清水，24 h后噴施稻瘟病菌分生孢子懸浮液。試驗組D：先噴施稻瘟病菌分生孢子懸浮液，24 h后分別噴施胞外抗菌物質(zhì)稀釋液、40%稻瘟靈(EC)稀釋液、75%三環(huán)唑(WP)稀釋液、PBS緩沖液和清水。
依據(jù)國際稻瘟病圃IRBN，葉瘟分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級為無病；1級為針頭狀大小褐點，無產(chǎn)孢中心；2級為稍大的褐點(直徑1~2 mm)，多數(shù)褐點位于植株下部葉片；3級為圓形稍長的灰色小病斑，多數(shù)病斑位于植株上部葉片；4級為典型紡錘形病斑，直徑3 mm以上，病斑面積4%；5級為典型病斑，病斑面積4%~10%；6級為典型病斑，病斑面積11%~25%；7級為典型病斑，病斑面積16%~50%；8級為典型病斑，病斑面積51%~75%；9級病斑面積75%以上。
發(fā)病率(%)=(發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100；
病情指數(shù)=[∑(各病級植株數(shù)×各級代表數(shù)值)/調(diào)查總植株數(shù)×最高級別值]×100；
防治效果(%)=(對照病指-處理病指/對照病指)×100。
1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行圖表制作，采用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行差異顯著性分析，不同字母表示在0.05水平上差異顯著。
2結(jié)果與分析
2.1 JN005菌株抑菌物質(zhì)產(chǎn)酶和產(chǎn)氣測定
經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，JN005菌株在膠體幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基和CAS培養(yǎng)基平板上沒有形成水解圈，但在脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基、纖維素酶選擇性培養(yǎng)基、0.2%可溶性淀粉培養(yǎng)基和β-1，3-葡聚糖酶培養(yǎng)基平板上形成水解圈，因而推測JN005菌株不能分泌幾丁質(zhì)酶和嗜鐵素，但能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和β-1，3-葡聚糖酶。JN005菌株的揮發(fā)性氣體對稻瘟病菌生長基本無影響，但JN005菌株的胞外抗菌物質(zhì)粗提液能夠有效拮抗稻瘟病菌生長。
圖1 JN005菌株產(chǎn)蛋白酶（A）、纖維素酶（B）、淀粉酶（C）和β-1，3-葡聚糖酶（D）的檢測
圖2 JN005菌株揮發(fā)性氣體(A)和胞外抗菌物質(zhì)(B)對稻瘟病菌的影響
2.2 JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性
實驗結(jié)果表明，在0℃~100℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高，JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液對稻瘟病菌的抑菌直徑會減小，但0℃和100℃處理對比，抑菌直徑只下降了2.11 mm；JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液在pH 2~12范圍內(nèi)拮抗稻瘟病菌活性較為穩(wěn)定，抑菌直徑未有大幅度變化，但pH=12處理最影響其活性；當(dāng)胞外抗菌物質(zhì)粗提液與蛋白酶K混合孵育后，抑菌直徑保持穩(wěn)定，未有活性損失，而木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和鏈蛋白酶則不同程度地降低了抑菌直徑；胞外抗菌物質(zhì)粗提液在紫外下照射時間越長抑菌直徑隨之下降，但照射12 h后依舊保持活性；胞外抗菌物質(zhì)粗提液在4℃下保存3個月以上仍然對稻瘟病菌生長具有拮抗作用，但隨著時間的推移抑菌直徑逐漸減小。
圖3不同處理對JN005菌株胞外抗菌物質(zhì)抑制稻瘟病菌菌絲生長穩(wěn)定性的影響
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