枯草芽孢桿菌JN005胞外抗菌物質對稻瘟病菌生長抑制作用研究（一）
摘要
【目的】檢測枯草芽孢桿菌JN005產生的胞外抗菌物質的穩(wěn)定性和對稻瘟病菌的生物活性，及其對水稻葉瘟的防治效果。
【方法】通過不同培養(yǎng)基檢測枯草芽孢桿菌JN005產生的抑菌物質，結合平板對峙法、光學顯微鏡觀察、室內離體和活體接種來檢測JN005菌株胞外抗菌物質對稻瘟病菌拮抗活性和對水稻葉瘟防治效果。
【結果】枯草芽孢桿菌JN005能分泌蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和β-1，3-葡聚糖酶，其胞外抗菌物質對稻瘟病菌生長具有抑制作用。胞外抗稻瘟病菌物質在0℃~100℃和pH 2~12范圍內活性較為穩(wěn)定，且經蛋白酶K處理后不影響其活性，紫外照射12 h以及4℃保存3個月仍有活性。胞外抗菌物質能引起稻瘟病菌菌絲形態(tài)畸變，并抑制分生孢子的萌發(fā)。室內湘晚秈12號稻瘟病離體葉片接種表明，先用100倍胞外抗菌物質稀釋液處理水稻葉片，24 h后接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液(1×105個/mL)，其葉瘟發(fā)病率為34.07%，效果接近稀釋500倍的40%稻瘟靈EC；而先接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液，24 h后用100倍胞外抗菌物質稀釋液處理，其發(fā)病率為38.52%，與稀釋1500倍的75%三環(huán)唑(WP)和稀釋500倍的40%稻瘟靈(EC)有顯著性差異。活體噴霧接種試驗表明，于湘晚秈12號秧苗長至3葉1心時，接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液前24 h噴施稀釋100倍的胞外抗菌物質稀釋液，其葉瘟防效為75.32%；接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液后24 h噴施稀釋100倍的胞外抗菌物質稀釋液，其防效為71.49%。
【結論】JN005菌株胞外抗菌物質對稻瘟病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)有直接抑制作用，且對環(huán)境穩(wěn)定性較好，對稻瘟病有較好的預防和治療作用，有進一步的開發(fā)潛力。
引言
稻瘟病是最具破壞性的水稻真菌性病害之一，每年能夠造成全球水稻減產10%~30%。盡管化學農藥能夠快速有效地防治植物病害，但過度使用會導致植物病原物的抗藥性上升和并影響食物安全。由于來自微生物代謝產物研發(fā)的生物農藥負面影響小、環(huán)境相容性和有害生物防治效果好，微生物代謝產物的研發(fā)成為全球農藥產業(yè)發(fā)展的重要途徑。
生防細菌目前主要包括芽孢桿菌、假單胞菌及鏈霉菌，其中芽孢桿菌是一類內生芽孢的革蘭氏陽性桿菌，其具有產生多種生物活性化合物的能力，因此是商業(yè)開發(fā)的首選。芽孢桿菌的生防機制包括競爭作用、拮抗作用、誘導植物抗病性三方面，拮抗作用是指生防菌在其生長代謝過程中產生的各種活性物質抑制病原菌的生長，在植物病害的防治中發(fā)揮著重要作用。近年已報道了芽孢桿菌的各種抗菌物質，如酶類、脂肽類、蛋白類物質，其活性范圍廣、毒性低、對環(huán)境友好，被認為是拮抗植物病原物的潛在藥劑。迄今為止，我國新登記的防治稻瘟病的芽孢桿菌制劑有19種，其中枯草芽孢桿菌、蠟質芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的分別為15種、3種和1種。
本實驗室于2014年從湖南桃江山區(qū)單季稻感稻瘟病品種湘早秈24號的感病稻叢的健康稻株中分離出817株菌株，采用平板對峙法，篩選出1株對稻瘟病菌具有高效抑制作用的枯草芽孢桿菌JN005，并已獲得中國國家發(fā)明專利。本研究初步分析枯草芽孢桿菌JN005菌株的抑菌物質，從中提取出對稻瘟病菌有拮抗效果的胞外抗菌物質，并對其抗菌活性和穩(wěn)定性進行了測定，同時，進一步研究了胞外抗菌物質對稻瘟病菌生長和致病性的影響，研究結果可為枯草芽孢桿菌JN005菌株的開發(fā)應用提供依據。
1材料與方法
1.1供試材料
供試拮抗菌枯草芽孢桿菌JN005是本課題組從湖南桃江山區(qū)單季稻感病品種湘早秈24號的感稻瘟病稻叢的健康稻株中分離獲得，供試病原菌稻瘟病菌TJ40-2-1，均由湖南農業(yè)大學植物病原微生物及水稻病害實驗室保存。
感稻瘟病品種湘晚秈12號來自湖南金色農豐種業(yè)有限公司。
40%稻瘟靈(EC)和75%三環(huán)唑(WP)分別來自江蘇龍燈化學有限公司和上海滬聯生物藥業(yè)（夏邑）股份有限公司。
1.2 JN005菌株抑菌物質的初步測定
將5μL的JN005菌株發(fā)酵液分別接在脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基、纖維素酶選擇性培養(yǎng)基、0.2%可溶性淀粉培養(yǎng)基、β-1，3-葡聚糖酶培養(yǎng)基、膠體幾丁質酶培養(yǎng)基和CAS培養(yǎng)基平板上，干燥后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24 h、48 h和72 h觀察菌落的生長情況和水解圈，每處理重復3次。
在NA培養(yǎng)基平板上劃線接種JN005菌株，同時在PDA培養(yǎng)基平板上接種6 mm稻瘟病菌菌餅，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移去兩個培養(yǎng)皿的皿蓋，將皿底相對而扣，上皿為接種稻瘟病菌菌餅平板，下皿為接種JN005菌株平板，并用封口膜將培養(yǎng)皿外側固定封口，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3~5 d后進行觀察，每處理重復3次，設不接JN005菌株的空白對照。
將JN005菌株接在NB培養(yǎng)液中，置于30℃、200 r/min搖床中發(fā)酵培養(yǎng)5 d后，4℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，用0.22μm細菌過濾器過濾得代謝產物液。采用硫酸銨分級沉淀法提取胞外抗菌物質：在常溫條件下，將固體硫酸銨研磨成粉末狀，邊緩慢加入代謝產物液中邊輕輕攪動液體直至充分溶解，使其飽和度達到80%，置于4℃下靜置24 h后析出深褐色沉淀，4℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取沉淀溶解于PBS緩沖液中，再將溶解好的液體裝于透析袋(8 000~14 000 D)中并置于相同PBS緩沖液中24 h透析除鹽，透析液用0.22μm細菌過濾器過濾后，將液體體積調整為代謝產物液體積的1/20，獲得胞外抗菌物質粗提液，用考馬斯亮藍法測定樣品濃度并檢測其抑制稻瘟病菌活性。按平板對峙法將6 mm稻瘟病菌菌餅接在PDA培養(yǎng)基平板中央位置，在距離菌餅中心左右25 mm處用6 mm打孔器各打一孔，向內各注入60μL的胞外抗菌物質粗提液(濃度為1.54 mg/mL)，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑，計算抑菌直徑[抑菌直徑(mm)=對照組菌落直徑(mm)–處理組菌落直徑(mm)]，每處理重復3次，設PBS緩沖液的空白對照。
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