孢漢遜酵母、美極梅奇酵母等菌株生長曲線測定及釀酒因子耐受性分析（二）
1.4葡萄汁發(fā)酵試驗(yàn)
‘美樂’葡萄除梗、壓榨破碎后，加入20 mg/L果膠酶和30 mg/L SO2，4℃浸漬24 h。浸漬結(jié)束后，參照LI等的方法，將葡萄醪在68℃下巴氏滅菌30 min后，迅速置于冰水中失活天然本土酵母菌群。取2 L葡萄醪液加入2.5 L棕色瓶中，接入酵母進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵瓶用8層紗布封口，發(fā)酵溫度控制在25℃。取樣時(shí)嚴(yán)格無菌操作。
菌株接種：分別將供試NS菌株培養(yǎng)液離心和無菌水洗滌，用滅菌葡萄汁溶解后以1×106 cfu/mL接入發(fā)酵瓶中，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)平行。每24 h定時(shí)取樣，監(jiān)測酵母生物量、還原糖與乙醇含量變化，連續(xù)2 d還原糖消耗量小于2 g/L即視為發(fā)酵結(jié)束。各處理取樣4℃保存，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)指標(biāo)檢測。
1.5酵母生物量測定
發(fā)酵過程中每24 h取樣，稀釋至10?4、10?5和10?6 3個(gè)梯度，分別均勻涂布于WL培養(yǎng)基。28℃恒溫培養(yǎng)3 d后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。所有樣品均重復(fù)3次。
1.6酒樣釀酒學(xué)指標(biāo)測定
發(fā)酵結(jié)束后，酒樣pH值、總酸、揮發(fā)酸和酒精度的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行。并參照下式計(jì)算不同NS菌株純種發(fā)酵后的還原糖消耗量、乙醇產(chǎn)量和乙醇產(chǎn)率。
式中Gc為還原糖消耗量，g/L；G0為還原糖初始量，g/L；Gr為還原糖剩余量，g/L；M為乙醇產(chǎn)量，g/L；φ為乙醇體積分?jǐn)?shù)，%；ρ為乙醇密度，g/L；Y為乙醇產(chǎn)率，%；
甘油、蘋果酸質(zhì)量濃度通過多功能葡萄酒分析儀（WineScan?3）檢測。
測定總酚、總花色苷?？偡訙y定采用福林酚法，以沒食子酸質(zhì)量濃度表示?？偦ㄉ蘸繙y定采用pH示差法。
吸取1 mL酒樣，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋10倍，之后在420、520、620 nm下測定吸光度，三者之和為酒樣的色度，前二者吸光度之比即為色調(diào)值。
1.7酒樣揮發(fā)性化合物測定
使用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對(duì)不同處理酒樣揮發(fā)性化合物進(jìn)行檢測。取8 mL酒樣于15 mL頂空瓶中，加入2.4 g NaCl和10μL 2-辛醇（質(zhì)量濃度為81.06 mg/L），加磁力攪拌轉(zhuǎn)子后封口，置于恒溫磁力攪拌器中，40℃水浴平衡30 min后頂空萃取30 min。GC-MS分析條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（60 m×2.5 mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度240℃，進(jìn)樣5 min，不分流進(jìn)樣；柱溫升溫程序：初溫50℃保持5 min，再以3.0℃/min升溫至200℃，保持15 min；載氣高純氦氣（He）流速1 mL/min；MS條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；質(zhì)譜掃描范圍20～350 m/z。
定性定量分析：對(duì)于已有標(biāo)準(zhǔn)品的香氣化合物通過內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量，其他香氣化合物含量利用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量分析。
1.8數(shù)據(jù)分析
采用Microsoft Office Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用IBM SPSS Statistics 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。其中，采用單因素方差分析（Duncan法，P＜0.05）進(jìn)行差異顯著性分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。TBtools、SIMCA 14.1與Origin 2021軟件用于繪圖。
將釀酒學(xué)參數(shù)與主要揮發(fā)性化合物測定結(jié)果相結(jié)合進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后使用Origin 2021進(jìn)行層次聚類分析；選取代表性菌株的新數(shù)據(jù)集進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），采用SIMCA 14.1提取結(jié)果并將其可視化，并利用Origin 2021繪制各變量相關(guān)回歸系數(shù)的條形圖。
2.結(jié)果與分析
2.1非釀酒酵母菌株生長曲線
由供試NS菌株在YPD液體培養(yǎng)基中的生長曲線（圖1）可知，同一種屬菌株表現(xiàn)出相似的生長趨勢，而不同種屬間的生長情況有一定差異。其中T.delbrueckii菌株（HX-6、HX-7）在經(jīng)歷4 h延滯期后迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，28 h左右達(dá)到穩(wěn)定期，最終OD600值達(dá)到1.4左右，生長速度和光密度值明顯高于其他菌株；H.uvarum菌株（HX-1、HX-3）同樣經(jīng)歷4 h延滯期后，在8～12 h期間生長速度較快、12～32 h期間生長較為緩慢并逐步達(dá)到穩(wěn)定期；M.pulcherrima菌株（HX-2、HX-4）對(duì)數(shù)生長期持續(xù)時(shí)間較長，40 h左右達(dá)到穩(wěn)定期，最大OD600值為1.102與1.098。
圖1非釀酒酵母菌株在YPD培養(yǎng)基中的生長曲線
注：HX-1、HX-3為H.uvarum；HX-2、HX-4為M.pulcherrima；HX-6、HX-7為T.delbrueckii。
2.2釀造因子耐受性
本土NS菌株對(duì)葡萄酒相關(guān)釀造因子的耐受性見圖2。除HX-6菌株外，其余菌株的生物量均隨葡萄糖質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)下降趨勢。葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到300 g/L時(shí)，HX-1、HX-3、HX-4菌株的OD600值明顯低于其他菌株（圖2a），表明其在高糖分條件下受到的抑制作用更強(qiáng)。由圖2b可知，所有菌株在10℃的低溫條件下均無法生長；15℃條件下，HX-2和HX-4菌株的生長情況明顯弱于其他菌株，而在35℃時(shí)，HX-1、HX-3菌株生長活力明顯下降。整體而言，同一種屬菌株對(duì)發(fā)酵溫度的耐受性具有一定相似性，不同種屬菌株對(duì)發(fā)酵溫度的耐受性存在明顯差異。
圖2非釀酒酵母菌株釀造因子耐受性
圖2c表明，6株NS菌株在SO2質(zhì)量濃度小于200 mg/L的范圍內(nèi)，均能夠正常生長；SO2質(zhì)量濃度達(dá)到300 mg/L時(shí)，除HX-6菌株外，其余菌株的生長僅受到輕微抑制，說明供試NS菌株具有較好的SO2耐受性。HX-7菌株在pH值為2.0和2.5的條件下無法生長，而HX-3菌株在pH值為2.0時(shí)生長受到輕微抑制；HX-2、HX-4、HX-6菌株隨著pH值的增加呈現(xiàn)OD600值升高的趨勢，HX-1菌株的光密度值在不同pH值條件下波動(dòng)不大（圖2d）。圖2e中，NS菌株均能耐受體積分?jǐn)?shù)為3%的乙醇，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時(shí)，除T.delbrueckii（HX-6、HX-7）外，其余酵母菌株的生長均受到不同程度的抑制；乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到9%時(shí)，HX-1、HX-3（H.uvarum）、HX-2、HX-4（M.pulcherrima）菌株均無法生長，但HX-6菌株的OD600吸光度值達(dá)到0.569，菌株生長受到一定抑制。
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