百里香酚MIC和生長(zhǎng)曲線測(cè)定及對(duì)金葡菌Hla的作用機(jī)制（一）
摘要:目的α-溶血素在金黃色葡萄球菌(金葡菌)肺炎的感染過(guò)程中起著非常重要的作用，可作為治療金葡菌肺炎的新靶標(biāo)。因此，研究百里香酚對(duì)金葡菌α-溶血素表達(dá)的影響具有重要意義。方法測(cè)定最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)和生長(zhǎng)曲線并進(jìn)行了溶血試驗(yàn)、蛋白免疫印跡分析、熒光定量PCR以及細(xì)胞毒性試驗(yàn)。結(jié)果百里香酚對(duì)金葡菌USA300的MIC為256μg/mL，亞抑菌質(zhì)量濃度的百里香酚(32μg/mL)可下調(diào)金葡菌hla和RNAIII的轉(zhuǎn)錄水平，降低α-溶血素的表達(dá)，對(duì)溶血素介導(dǎo)的肺癌上皮細(xì)胞A549損傷具有保護(hù)作用。結(jié)論百里香酚具有成為新型抗金葡菌感染藥物的潛力。
金黃色葡萄球菌(金葡菌)是一種常見(jiàn)的條件性致病菌，它廣泛地存在于人和動(dòng)物體內(nèi)。當(dāng)宿主的非特異性免疫系統(tǒng)出現(xiàn)缺陷時(shí)，金葡菌可以感染宿主，引起多種疾病，給人和動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重的威脅。其中最典型的疾病就是金葡菌肺炎，具有高發(fā)病率、高致死率的特點(diǎn)。目前常采用抗生素治療金葡菌肺炎，但是抗生素在使用過(guò)程中會(huì)對(duì)金葡菌的生長(zhǎng)造成巨大的選擇性壓力，使菌群中耐藥菌的比例上升，甚至出現(xiàn)多重耐藥株，使得臨床治療效果下降甚至無(wú)效。因此，我們迫切需要新的藥物或治療策略來(lái)防治細(xì)菌感染尤其是耐藥菌的感染。
抗毒力因子治療策略是抑制細(xì)菌毒力因子的表達(dá)或其活性的一種治療策略。這些毒力因子通常是細(xì)菌生長(zhǎng)的非必需蛋白，以此為目標(biāo)進(jìn)行特異性干預(yù)，不會(huì)對(duì)細(xì)菌的生存帶來(lái)選擇性壓力，因而不易產(chǎn)生耐藥性而受到廣泛關(guān)注。α-溶血素(Hla)是金葡菌的一種重要的毒力因子，在金葡菌感染肺部的過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。因此，Hla可以作為一種新的抗金葡菌肺炎的潛在靶標(biāo)。
百里香酚(thymol)又名麝香草酚，是一種主要從唇形科植物中提取的單萜酚，為傘花烴的衍生物，與香芹酚互為同分異構(gòu)體。百里香酚具有多種藥理活性，如抗氧化、抗寄生蟲(chóng)、抗菌、調(diào)節(jié)免疫和促生長(zhǎng)等。我們通過(guò)體外溶血實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃Y選藥物時(shí)，發(fā)現(xiàn)百里香酚具有抑制菌上清溶血的作用。本研究首先進(jìn)行MIC和生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，然后通過(guò)蛋白免疫印跡和熒光定量PCR試驗(yàn)來(lái)探討百里香酚對(duì)金葡菌Hla的作用機(jī)制，再通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)研究百里香酚對(duì)金葡菌Hla介導(dǎo)的肺癌上皮細(xì)胞A549損傷的保護(hù)作用，為百里香酚治療金葡菌肺炎提供理論依據(jù)。
1.材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株和細(xì)胞株
金葡菌菌株USA300和人肺癌上皮細(xì)胞A549(ATCC CCL 185)購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。
1.1.2主要試劑
百里香酚(HPLC 98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；TSB培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；α-溶血素多克隆抗體和溶葡萄球菌素(Sigma公司)；羊抗兔二抗(Solarbio公司)；PVDF膜(Pall公司)；Super ECL Plus超敏發(fā)光液(Thermo fisher公司)；Qiagen RNeasy Maxi column(Qiagen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑Takara RNA PCR kit(AMV)Ver.3.0和熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex Taq TM(Takara公司)；Cytotoxicity Detection Kit(LDH，Roche公司)；live/dead(green/red)reagent(Invitrogen公司)。
1.2方法
1.2.1百里香酚對(duì)金葡菌最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測(cè)定
按照臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的倍比稀釋法測(cè)定百里香酚對(duì)金葡菌的最小抑菌質(zhì)量濃度，苯唑西林作為對(duì)照組。
1.2.2百里香酚在亞抑菌質(zhì)量濃度下對(duì)金葡菌USA300的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
將金葡菌USA300過(guò)夜培養(yǎng)后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待金葡菌生長(zhǎng)到OD600 nm=0.3時(shí)，加入不同量的百里香酚使其質(zhì)量濃度分別達(dá)到0、4、8、16和32μg/mL，隔一段時(shí)間測(cè)定菌液OD600 nm值。
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