清開靈注射液對(duì)金葡菌生長(zhǎng)代謝的抑制作用（二）
摘要:通過研究清開靈注射液對(duì)金葡菌生長(zhǎng)代謝的影響，探索建立基于生物活性圖譜的清開靈注射液的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。本研究采用微量量熱法，考察藥物作用于金葡菌的生物熱效應(yīng);對(duì)所測(cè)得的熱輸出曲線進(jìn)行擬合，獲得系列熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)比分析各項(xiàng)熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)及熱輸出曲線。結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)(0~5.00%)，隨清開靈劑量增加，金葡菌生長(zhǎng)曲線呈“下降”趨勢(shì)且指數(shù)生長(zhǎng)期后延;其熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)T1、T2、k1、P1、P2、I均與清開靈劑量呈現(xiàn)線性關(guān)系。清開靈注射液對(duì)金葡菌的半數(shù)抑菌量為3.26%，最佳抑菌量為5.47%;各類不同的清開靈注射液樣品作用下的金葡菌生長(zhǎng)曲線存在不同程度差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清開靈注射液對(duì)金葡菌生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，通過微量量熱法研究，可對(duì)清開靈注射液的質(zhì)量一致性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
清開靈注射液是傳統(tǒng)名方“安宮牛黃丸”的改良劑型，由膽酸、珍珠母(粉)、豬去氧膽酸、梔子、水牛角(粉)、板藍(lán)根、黃芩苷、金銀花8味中藥組成，成分復(fù)雜。清開靈主要用于熱病、神昏、中風(fēng)偏癱、神志不清、急性肝炎、上呼吸道感染、肺炎、腦血栓形成、腦出血等。但是，隨著清開靈注射液臨床應(yīng)用日益廣泛，其引發(fā)的不良反應(yīng)也時(shí)有報(bào)道。盡管目前針對(duì)清開靈注射劑質(zhì)量評(píng)價(jià)也發(fā)展了許多基于化學(xué)成分的方法，但由于未直接與生物活性相關(guān)聯(lián)，目前尚無有效控制質(zhì)量一致性與穩(wěn)定性的方法進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用。
目前，在中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)研究中，生物評(píng)價(jià)已成為發(fā)展方向與熱點(diǎn)之一。國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)針對(duì)已上市的中藥注射劑明確要求:“建立生物活性檢測(cè)方法，以彌補(bǔ)目前檢驗(yàn)指標(biāo)僅僅能控制已知成分的不足，從生物活性角度控制藥品的質(zhì)量?！痹谧⑸湟嘿|(zhì)量評(píng)價(jià)體系中引入生物評(píng)價(jià)方法具有其研究前景?，F(xiàn)代藥理研究表明，清開靈注射液主要有解熱鎮(zhèn)靜、抗菌、治療腦缺血、抗凝促溶、免疫調(diào)節(jié)等作用。臨床上，清開靈注射液常用于熱病、急性上呼吸道感染及肺炎等，這與清開靈注射液具有良好的抗菌作用密不可分。微量量熱法，作為一種快速非侵入性的方法，近年來被廣泛應(yīng)用于對(duì)物質(zhì)抗菌能力的考察。結(jié)合課題組前期研究工作，本文采用微量量熱法考察清開靈注射液對(duì)金葡菌生長(zhǎng)代謝行為的影響，并對(duì)其抑菌作用參數(shù)進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)。
材料與方法
儀器:LKB-2277生物熱活性檢測(cè)系統(tǒng),LKB-2132蠕動(dòng)泵(瑞典Thermometric公司)。
藥品與試劑:清開靈注射液樣品共6批，由具代表性的兩大生產(chǎn)廠家(BZY、SXTH)提供，各提供3批,樣品批號(hào)分別為:811601、712604A、710510A和070930、071120、071219。
實(shí)驗(yàn)材料:金葡菌Staphylococcus aureus(武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心,CCTCC AB910393)。
培養(yǎng)基配制:LB培養(yǎng)基:取蛋白胨胨10.0 g,酵母粉5.0 g,氯化鈉5.0 g,加蒸餾水至1 L,調(diào)節(jié)pH至7.0~7.2,分裝后于121°C高壓蒸氣滅菌20 min,置4°C備用。
生長(zhǎng)熱功率輸出曲線采集:采用停流法檢測(cè)。系統(tǒng)溫度設(shè)定為37℃，測(cè)定前分別用適量0.1mol·L氫氧化鈉、0.1mol·L-鹽酸、75%乙醇溶液和無菌水清洗管道和流通池，待儀器獲得穩(wěn)定基線后，用蠕動(dòng)泵以50mL·h-l的流速，將菌液和清開靈注射液混合液泵入微量量熱儀中;當(dāng)樣品充滿流通池后停泵，啟動(dòng)采集卡開始采集數(shù)據(jù)，跟蹤記錄流通池內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)的產(chǎn)熱曲線(P-t曲線)，當(dāng)產(chǎn)熱曲線數(shù)據(jù)重新回到基線后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
樣品對(duì)金葡菌生長(zhǎng)代謝影響測(cè)定:根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將一定量的清開靈注射液加入到接種了金葡菌的培養(yǎng)液中，使最終菌懸液菌濃度為2x106CFU·mL-1振蕩混勻，以備進(jìn)樣。整個(gè)過程為無菌操作。
結(jié)果
1金葡菌的生長(zhǎng)熱功率輸出曲線
圖1是37℃下，停流法測(cè)定的金葡菌完整代謝曲線。曲線a(P-t曲線)是所測(cè)定的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，可以分成4個(gè)階段:I停滯期、II指數(shù)生長(zhǎng)期、III穩(wěn)定期和IV衰亡期。分別對(duì)應(yīng)于細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)成分的利用情況及不同的代謝過程，與傳統(tǒng)方法測(cè)定的細(xì)菌代謝曲線相似。曲線b(lnP-t曲線)則顯示了線性擬合后細(xì)菌代謝熱功率輸出隨時(shí)間的變化特征。
根據(jù)微生物生長(zhǎng)代謝的特征和化學(xué)動(dòng)力學(xué)、熱動(dòng)力學(xué)原理,建立了多種基于細(xì)菌細(xì)胞的熱動(dòng)力學(xué)模型,其中以指數(shù)模型最為常用。根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)指數(shù)模型,在細(xì)菌生長(zhǎng)過程中的指數(shù)生長(zhǎng)期,其產(chǎn)熱功率Pt與生長(zhǎng)速率常數(shù)k有如下關(guān)系:
Pt=P0exp(k t)或ln Pt=ln P0+k t
式(1)中的Pt就是產(chǎn)熱曲線中指數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)t時(shí)刻的輸出熱功率,將圖譜的指數(shù)生長(zhǎng)期Pt、t值代入公式(1)中，進(jìn)行線性擬合可得金葡菌的生長(zhǎng)速率常數(shù)k值。
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