快速藥物敏感性檢測：熒光素酶生物發(fā)光法與微量肉湯稀釋法的對比分析（三）
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在臨床抗感染治療過程中，藥敏實(shí)驗(yàn)可以相對快速有效地檢測病原菌對各種抗菌藥物的敏感性，來指導(dǎo)臨床合理用藥，以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。臨床常規(guī)藥敏試驗(yàn)包括紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)、稀釋法(包括肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法)、E-test法、Vitek、Microscan、PHOENIXTM System、AST等自動化藥敏分析儀，但都需要較長的孵育時間或高緊密性儀器，從而延遲致病菌感染的有效治療。ATP是生物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體，同時也是螢火蟲熒光素酶催化發(fā)光產(chǎn)生熒光的條件之一，活菌體內(nèi)ATP水平處于相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡，其含量可以作為細(xì)菌生長及細(xì)菌計(jì)數(shù)的指標(biāo)。鐘敏等建立了熒光素酶催化反應(yīng)快速測定結(jié)核分枝桿菌藥敏結(jié)果的試驗(yàn)方法，在(6.6±2.1)d內(nèi)獲得的藥敏結(jié)果與羅氏培養(yǎng)法符合率為95.2%。為適應(yīng)臨床治療的迫切性，本研究基于熒光素酶催化反應(yīng)和自動化儀器試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)對微量肉湯法藥敏時縮短至6 h內(nèi)，利用熒光素酶反應(yīng)體系和細(xì)菌生長繁殖或裂解后釋放出的ATP反應(yīng)發(fā)射熒光，可直接、準(zhǔn)確測定MIC，可為臨床醫(yī)生提供及時的用藥方案，有效降低患者感染死亡率。
| 革蘭陽性菌 | 例數(shù)/株 | 頭孢西丁% | 慶大霉素% | 紅霉素% | 萬古霉素% | 呋喃妥因% | 利奈唑胺% | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | ||
| 金黃色葡萄球菌 | 18 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 83.33 | 83.33 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 88.89 | 94.44 | 100.00 |
| 表皮葡萄球菌 | 18 | 94.44 | 88.89 | 100.00 | 100.00 | 94.44 | 94.44 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 88.89 | 93.30 | 94.44 |
| 糞腸球菌 | 22 | 100.00 | / | 95.45 | / | 95.45 | 95.20 | 100.00 | 100.00 | 90.00 | 66.67 | 100.00 | 95.50 |
| 屎腸球菌 | 21 | 100.00 | / | 95.23 | / | 95.24 | 83.71 | 50.08 | 100.00 | 100.00 | 68.24 | 100.00 | 100.00 |
| 肺炎鏈球菌 | 14 | 90.00 | / | 93.75 | / | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | / | 78.75 | 100.00 | |
| 總計(jì) | 93 | 97.39 | 94.44 | 96.29 | 100.00 | 93.54 | 93.04 | 97.85 | 100.00 | 97.35 | 84.81 | 92.97 | 90.32 |
| 注：“/”代表該藥敏無試驗(yàn)數(shù)據(jù) | |||||||||||||
本研究利用熒光素酶生物發(fā)光法對大腸埃希菌ATCC29292、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212與篩選的抗生素相互作用產(chǎn)生熒光，建立反應(yīng)體系及發(fā)光曲線模型，根據(jù)熒光折點(diǎn)定義MIC。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)熒光素酶生物發(fā)光法檢測上述菌株對10抗生素的MIC與微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性為100%。為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的可行性及準(zhǔn)確性，篩選了184株臨床分離菌株，包含金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和屎腸球菌等在內(nèi)的93株革蘭陽性菌，和包含大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、奇異變形桿菌等91株革蘭陰性菌，其中革蘭陽性菌熒光素酶生物發(fā)光法與微量肉湯肉湯對比EA和CA值有較高的符合率，但呋喃妥因?qū)瘘S色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎腸球菌出現(xiàn)較低的分類結(jié)果，可能由于呋喃妥因腸球菌類抗菌藥，其作用機(jī)制為干擾細(xì)菌體內(nèi)氧化還原酶系統(tǒng)，其氧化還原能力與ATP含量無強(qiáng)相關(guān)性影響。
利奈唑胺為惡唑烷酮類抗生素，通過作用于細(xì)菌50s核糖體亞單位抑制蛋白質(zhì)的合成，在與糞腸球菌作用中表現(xiàn)出較低的CA值(僅為66.67%)，可能與利奈唑胺抑菌生長作用相關(guān)，需忽略部分熒光信號。
革蘭陰性菌對比EA和CA值分別大于90%和80%，其中假單胞菌屬為專性需氧菌，培養(yǎng)前期生長緩慢延遲期較長，需適當(dāng)延長孵育時間，減少假陰性孔的產(chǎn)生。同時有研究表明部分抗生素作用細(xì)菌可伴隨快速生長(relative rapid growth，RRG)，如環(huán)丙沙星和苯唑西林；和相對低速生長(relative slow growth，RSG)，如紅霉素和利奈唑胺。RRG和RSG現(xiàn)象可導(dǎo)致依賴檢測生物量或次級代謝產(chǎn)物原理的快速藥物敏感性測試方法(如熒光素酶生物發(fā)光法)對部分濃度的抗生素孔出現(xiàn)假陽或假陰的判斷，降低測試符合率，但可通過延長孵育時間或修正對應(yīng)抗生素的判讀規(guī)則進(jìn)行改正。
綜上所述，該研究認(rèn)為熒光素酶生物發(fā)光法主要通過檢測熒光折點(diǎn)判斷MIC，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)監(jiān)測并具有良好的準(zhǔn)確性，判讀更直接客觀、耗時短等優(yōu)點(diǎn)，可為臨床檢測病原菌快速、精準(zhǔn)選擇抗生素治療提供依據(jù)。
| 革蘭陰性菌 | 例數(shù)/株 | 美羅培南% | 環(huán)丙沙星% | 妥布霉素% | 阿米卡星% | 頭孢他啶% | 頭孢噻肟% | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | EA | CA | ||
| 大腸埃希菌 | 15 | 93.33 | 93.33 | 93.33 | 83.70 | 92.85 | 92.85 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 92.85 | 93.33 |
| 鮑曼不動桿菌 | 14 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 92.85 | 92.85 | 100.00 | 92.85 | 92.85 | 92.85 | 100.00 | 100.00 |
| 奇異變形桿菌 | 14 | 92.85 | 97.75 | 93.00 | 93.50 | 93.00 | 93.00 | 100.00 | 100.00 | 93.75 | 93.70 | 93.75 | 100.00 |
| 陰溝腸桿菌 | 16 | 100.00 | 97.95 | 93.75 | 91.25 | 93.00 | 93.00 | 100.00 | 100.00 | 93.75 | 93.75 | 100.00 | |
| 銅綠假單胞菌 | 16 | 93.75 | 100.00 | 93.75 | 91.25 | 96.70 | 96.70 | 100.00 | 93.80 | 90.00 | 90.00 | 93.75 | 97.85 |
| 總計(jì) | 91 | 95.60 | 96.90 | 95.70 | 93.70 | 96.00 | 96.00 | 100.00 | 98.00 | 96.70 | 96.70 | 94.50 | 97.80 |
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