快速藥物敏感性檢測：熒光素酶生物發(fā)光法與微量肉湯稀釋法的對比分析（一）
摘要：目的通過熒光素酶生物發(fā)光法與微量肉湯稀釋法對質控菌株和臨床收集菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)進行測定,探討熒光素酶生物發(fā)光法在病原微生物快速藥物敏感性試驗中的應用價值。方法以D-熒光素鈉、Mg2+、O2和待測菌株為熒光素酶催化反應底物,連續(xù)檢測待測菌與抗生素孵育過程中相對光強度(relative light unit,RLU)變化,計算發(fā)光率并確定MIC,分析與微量肉湯稀釋法的基本一致性(essential agreement,EA)和分類一致性(categorical agreement,CA)。結果熒光素酶生物發(fā)光法快速檢測大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等質控菌株MIC與微量肉湯稀釋法檢測MIC結果CA和EA值均為100%;并應用該檢測體系對91株臨床革蘭陰性菌樣本、93株革蘭陽性菌樣本進行MIC測定,革蘭陰性菌檢測結果中的6種藥物EA和CA分別大于90%和84%,革蘭陽性菌檢測結果中的6種藥物EA和CA分別大于90%和80%,并使檢測周期由常規(guī)藥敏實驗的16~24 h縮短至5~6 h。結論熒光素酶生物發(fā)光法快速檢測藥敏結果與微量肉湯稀釋法結果具有較高一致性,且更快速、敏感,可為今后的臨床檢驗工作提供全新的快速藥敏檢測方法。
病原菌生物藥敏試驗結果是臨床醫(yī)師治療細菌性感染、合理選用藥物、提高療效和避免濫用抗菌藥物的重要依據(jù)。然而，由于抗生素耐藥性的普遍產(chǎn)生，在2017年造成20000例細菌感染患者死于細菌耐藥性。因此，必須加強病原菌對藥物的敏感性檢測，及時準確地監(jiān)測細菌對藥物敏感性和耐藥性的改變。目前臨床普遍采用美國臨床實驗室標準化委員會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的擴散法和稀釋法，但這兩種方法的共同缺陷是測定結果所需時間長，一般需約24~72 h。而對于感染性疾病的針對性治療措施開展越早，對感染的控制效果也愈好。因此，建立1種快速藥物敏感試驗方法無論在臨床疾病治療，或是對于流行病學調查都非常必要。
熒光素酶(lucierase)是自然界中能催化熒光氧化并產(chǎn)生生物光的一類酶的統(tǒng)稱。1947年，McElory發(fā)現(xiàn)螢火蟲發(fā)光的必不可少的底物是腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，利用提取液得到熒光素酶。1985年，de Wet等又成功高效表達系統(tǒng)完整表達了北美螢火蟲熒光素酶基因。在熒光素酶催化發(fā)光體系中，當熒光素等其它底物過量時，催化產(chǎn)生的相對熒光強度RLU與游離的ATP含量成正相關。而微生物胞內ATP含量相對穩(wěn)定，在與青霉素、頭孢類等抗生素作用后，細胞壁合成中間轉肽酶結合而抑制肽聚糖的交聯(lián)，致使細胞壁合成受阻，胞外水分進入菌體引起細胞腫脹、變形，最后破裂溶解而死亡。細胞破壞后，細胞中的ATP會完全釋放出來，根據(jù)上述方法可以通過測量ATP的含量間接評估細菌的數(shù)量或細胞完整性，縮短檢測時間，提高檢測效率。因此，本研究基于熒光素酶生物發(fā)光法建立快速耐藥菌藥物敏感性檢測體系，并將檢測結果與肉湯稀釋法進行對比分析，確定熒光MIC，可克服常規(guī)檢測周期較長、檢測滯后性的缺點，及時指導臨床抗感染治療精準用藥。
1材料與方法
1.1試驗菌株
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29213、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)ATCC29212、大腸埃希菌(Escherichia coli)ATCC29292、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853標準菌株均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。臨床驗證菌株收集于鄭州市中心醫(yī)院臨床樣本，包括革蘭陰性菌91株、革蘭陽性菌93株。
1.2儀器與試劑
化學發(fā)光免疫分析儀LUMO(鄭州安圖試驗儀器有限公司)，Mueller-Hinton Broth培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司)，ATP標準品(Roche公司)，熒光素酶、D-熒光素鈉鹽(上海源葉生物科技有限公司)，Mueller-Hinton肉湯(Oxoid公司)，頭孢西丁、呋喃妥因、利奈唑胺、慶大霉素、紅霉素、萬古霉素、美羅培南、環(huán)丙沙星、妥布霉素、阿米卡星、頭孢噻肟和頭孢他啶(大連美侖生物技術有限公司)，血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)。
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