雪茄煙中霉菌培養(yǎng)基種類篩選、計(jì)數(shù)方法適用性研究（一）
摘要：為明確霉菌計(jì)數(shù)方法對(duì)雪茄煙的適用性，采用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和SYMPHONY Agar快速顯色培養(yǎng)基對(duì)13種雪茄煙進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)，評(píng)價(jià)3種培養(yǎng)基在不同接種方式條件下雪茄煙中霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性，并對(duì)各霉菌計(jì)數(shù)方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明：①同種接種方式條件下，3種培養(yǎng)基的霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性較好；②相同培養(yǎng)基條件下，平板涂布法操作更簡便，菌落分布均勻，典型菌落更易判讀；③3種霉菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基相比，SYMPHONY Agar快速顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)周期短，霉菌典型菌落大小均勻，更容易計(jì)數(shù)。因此，SYMPHONY Agar快速顯色培養(yǎng)基和平板涂布法接種方式更適合于雪茄煙中的霉菌計(jì)數(shù)。
霉變是煙草及煙草制品存儲(chǔ)中需要重點(diǎn)研究解決的關(guān)鍵問題之一，霉變除影響煙草及煙草制品感官品質(zhì)外還可能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1,4-6]。雪茄煙與傳統(tǒng)卷煙相比，更易發(fā)生霉變，而預(yù)防和控制雪茄煙霉變的前提是能夠快速準(zhǔn)確地檢測雪茄煙中的霉菌含量，評(píng)估雪茄煙霉變發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。由于雪茄煙生產(chǎn)及存儲(chǔ)的特殊性和霉菌的差異性，尋找更加適合于雪茄煙中霉菌計(jì)數(shù)的方法尤為重要。
國內(nèi)外食品行業(yè)出臺(tái)了霉菌計(jì)數(shù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，如ISO 21527—2:2008,GB 4789.15—2016和美國FDA官方檢測方法等，這些微生物學(xué)霉菌計(jì)數(shù)方法主要采用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，推薦使用平板傾注法或平板涂布法兩種接種方式。煙草行業(yè)也參考食品相關(guān)檢測方法建立了煙草及煙草制品中霉菌計(jì)數(shù)方法標(biāo)準(zhǔn)，采用改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行平板傾注法接種。林華清等針對(duì)煙草及煙草制品中8種常見霉菌，對(duì)霉菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基種類進(jìn)行了篩選，但未對(duì)實(shí)際煙草樣品進(jìn)行適用性驗(yàn)證和分析。
由于不同類型煙草及煙草制品中霉菌種類較多且存在差異性，同時(shí)培養(yǎng)基種類和接種方式也直接影響計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性，若在同等條件下將樣品中的霉菌盡可能多地培養(yǎng)出來，有必要對(duì)適宜的培養(yǎng)基種類進(jìn)行系統(tǒng)比較和篩選，并優(yōu)化接種方式，以得到穩(wěn)定準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。為此，對(duì)目前的霉菌計(jì)數(shù)方法綜合分析后，選用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基（GB法推薦用培養(yǎng)基）,改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YC/T法推薦用培養(yǎng)基）和SYMPHONY Agar快速顯色培養(yǎng)基（Biokar法推薦用培養(yǎng)基）等3種培養(yǎng)基，采用平板涂布法與平板傾注法兩種接種方式對(duì)國內(nèi)市售13種雪茄煙進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)，研究3種培養(yǎng)基在不同接種方式條件下雪茄煙中霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的差異性及霉菌形態(tài)的變化，并對(duì)各霉菌計(jì)數(shù)方法進(jìn)行適用性評(píng)價(jià)，旨在為篩選出適宜雪茄煙的霉菌計(jì)數(shù)方法提供參考。
1材料與方法
1.1樣品信息
從視覺,嗅覺的角度，根據(jù)雪茄煙的霉變程度，選擇國內(nèi)市售13種具有代表性的雪茄煙（見表1）作為試驗(yàn)樣品。13個(gè)樣品按茄芯原料形態(tài)分類，分為煙束（8種）,煙片（4種）和煙絲（1種）三類；按制作方式分為手制（10種）,半手制（1種）和機(jī)制（2種）三類；按包裝形式分為木盒（4種）,紙盒（7種）和鐵盒（2種）三類。
表1 13種雪茄煙樣品基本信息Tab.1 Basic information of 13 cigar samples
| 樣品編號(hào) | 茄芯原料形態(tài) | 制作方式 | 包裝形式 |
|---|---|---|---|
| A | 煙束 | 手制 | 木盒 |
| B | 煙束 | 手制 | 紙盒 |
| C | 煙束 | 手制 | 紙盒 |
| D | 煙束 | 手制 | 鐵盒 |
| E | 煙片 | 機(jī)制 | 紙盒 |
| F | 煙片 | 機(jī)制 | 鐵盒 |
| G | 煙束 | 手制 | 木盒 |
| H | 煙片 | 手制 | 紙盒 |
| I | 煙片 | 手制 | 木盒 |
| J | 煙絲 | 半手制 | 紙盒 |
| K | 煙束 | 手制 | 紙盒 |
| L | 煙束 | 手制 | 木盒 |
| M | 煙束 | 手制 | 紙盒 |
1.2儀器與試劑
Bagmixer®400均質(zhì)器（法國Interscience公司）；HZT-2000電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；CL-40M高壓滅菌鍋（日本AUTOCLVAE公司）；SCAN 1200自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器（法國Interscience公司）；VORTEX 1渦旋振蕩器（德國IKA公司）；CTHI-250B2恒溫恒濕箱（上海施都凱儀器設(shè)備有限公司）。
孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制備）；SYMPHONY Agar快速顯色培養(yǎng)基（法國Solabia集團(tuán)Biokar公司）；225 mL磷酸鹽緩沖液,無菌培養(yǎng)皿,無菌L型涂布棒,無菌均質(zhì)袋（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。
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