不同保存條件、培養(yǎng)基對淋病奈瑟菌存活率的影響——摘要、材料與方法
摘要： 目的 優(yōu)化淋病奈瑟菌（簡稱淋球菌）的分離培養(yǎng)及保存方法。方法 采用自制淋球菌選擇性培養(yǎng)基與7種商品化淋球菌選擇性培養(yǎng)基［淋球菌分離培養(yǎng)板、淋球菌（T-M）選擇培養(yǎng)基、巧克力平板（淋球菌）、淋球菌選擇培養(yǎng)基、MTM瓊脂平板、一次性GC瓊脂培養(yǎng)基、淋球菌瓊脂平板］分別培養(yǎng)5株質(zhì)控菌（1號淋球菌、2號淋球菌、黏液奈瑟菌、糞腸球菌、混合菌），評估培養(yǎng)基效能。通過燭缸內(nèi)、外培養(yǎng)法培養(yǎng)16株淋球菌，篩選CO2依賴型菌株；評估4種自制淋球菌保存液（10%二甲基亞砜小牛血清、10%甘油小牛血清、20%甘油腦心浸液及30%甘油胰酶大豆肉湯）保存淋球菌的效果；觀察淋球菌在凍干和未凍干狀態(tài)下的存活情況。
結(jié)果 5株質(zhì)控菌株在不同的淋球菌商品化培養(yǎng)基上生長效果存在差異，1號淋球菌在自制培養(yǎng)基和MTM瓊脂平板上生長的菌落大且數(shù)量多，優(yōu)于其他6種培養(yǎng)基；2號淋球菌在7種商品化培養(yǎng)基中生長情況均不如自制培養(yǎng)基；7種商品化培養(yǎng)基對黏液奈瑟菌生長均有抑制作用，其中自制培養(yǎng)基、巧克力平板（淋球菌）、MTM瓊脂平板、一次性GC瓊脂培養(yǎng)基、淋球菌瓊脂平板能完全抑制其生長；淋球菌（T-M）選擇培養(yǎng)基能完全抑制糞腸球菌的生長；混合菌在自制培養(yǎng)基淋球菌分離培養(yǎng)板、淋球菌（T-M）選擇培養(yǎng)基、巧克力平板（淋球菌）、MTM瓊脂平板及一次性GC瓊脂培養(yǎng)基等培養(yǎng)基上分離效果較好。在有CO?環(huán)境下，16株淋球菌均呈現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)；無CO?條件下，11株淋球菌生長受到明顯的抑制。4種保存液在-70 ℃條件下保存效果未見差異，保存12個月時均可見培養(yǎng)菌落融合成片；在-20 ℃條件下，30%甘油胰酶大豆肉湯保存效果最好，6個月時仍有少數(shù)存活；10%二甲基亞砜小牛血清保存效果最差，2周時僅部分存活。
未凍干的淋球菌在不同溫度（4 ℃、-18 ℃、-29 ℃、-70 ℃和液氮）下的保存時間存在差異，4 ℃保存第4天即無淋球菌存活；凍干后的淋球菌在4 ℃保存6個月仍可存活（菌落融合成片）。結(jié)論 自制淋球菌選擇性培養(yǎng)基對淋球菌的培養(yǎng)及分離效果優(yōu)于商品化淋球菌選擇性培養(yǎng)基；少量的CO2可以促進淋球菌生長；超低溫及凍干保存淋球菌可以提高淋球菌存活時間，4 ℃凍干保存是最經(jīng)濟有效的長期保存方案。
引言
淋病是我國法定報告的乙類傳染病，也是我國目前重點防控的性傳播疾病之一。該病的病原體淋病奈瑟菌（簡稱淋球菌）的培養(yǎng)受多種因素影響，包括規(guī)范的標本取材、培養(yǎng)基的質(zhì)量、適宜的培養(yǎng)溫度以及一定濃度的CO?。淋球菌除對培養(yǎng)條件要求苛刻，其菌株的長期保存也面臨許多困難，目前常用的脫脂牛奶保存法存在保存效果不穩(wěn)定、存活時間短等問題，給淋球菌耐藥監(jiān)測及其相關(guān)科研工作帶來諸多不便。雖然冷凍干燥法被認為是細菌保存的最佳方法，但其操作復(fù)雜，費時費力且設(shè)備昂貴，在淋球菌保存中的實際效果需要進一步驗證[5]。本研究旨在系統(tǒng)評估不同保存條件對淋球菌存活率的影響，為淋球菌的運輸、標本庫的建立及標準化管理提供科學(xué)依據(jù)。
一、材料與方法
1.菌株來源：
4株淋球菌參考菌株，編號ATCC49226、WHOG、WHOJ、WHOL，來自世界衛(wèi)生組織西太區(qū)。5株質(zhì)控菌株：1號、2號為淋球菌，編號ATCC49226、WHOG，來自世界衛(wèi)生組織西太區(qū)；黏液奈瑟菌（Neisseria mucosa），編號ATCC19695，糞腸球菌（Enterococcus faecalis），編號ATCC29212，來自美國典型菌種保藏中心；混合菌含1株淋球菌（編號ATCC49226）和1株糞腸球菌（編號ATCC29212）。16株淋球菌臨床分離株，編號分別為NJ08-91、NJ08-92、NJ08-93、NJ08-94、NJ08-99、NJ08-100、NJ08-101、NJ08-102、NJ08-104、NJ08-105、NJ08-106、NJ08-107、NJ08-112、NJ08-117、NJ08-118、NJ08-136，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院性病科。
2.培養(yǎng)基及保存試劑：
自制淋球菌選擇性培養(yǎng)基，成分為3.6%的GC基礎(chǔ)粉、0.4%的VCN抑制劑（英國Oxoid公司）、2%的Vso-Vitalex增菌劑（英國Oxoid公司）、2%的血紅蛋白粉。7種商品化淋球菌選擇性培養(yǎng)基分別為淋球菌分離培養(yǎng)板（珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司）、淋球菌（T-M）選擇培養(yǎng)基（南京迪景生物制品有限公司）、巧克力平板（淋球菌）（廣州市景泉微生物科技有限公司）、淋球菌選擇培養(yǎng)基（江門市凱林貿(mào)易有限公司）、MTM瓊脂平板（上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司）、一次性GC瓊脂培養(yǎng)基（天津市金章科技發(fā)展有限公司）、淋球菌瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）。凍存基質(zhì)：脫脂牛奶、甘油、二甲基亞砜、小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、腦心浸液及胰酶大豆肉湯（美國BD公司）；凍干保護劑：脫脂牛奶。
3.培養(yǎng)基性能評估：
從4℃冰箱取出5株質(zhì)控菌株，各加300μl無菌生理氯化鈉溶液后混勻，用移液器分別取出10μl菌液接種到經(jīng)過預(yù)溫的自制淋球菌培養(yǎng)基及7種商品化淋球菌選擇性培養(yǎng)基，并作四區(qū)劃線培養(yǎng)，置于36℃培養(yǎng)箱中燭缸培養(yǎng)36 h，記錄菌落形態(tài)，包括菌落大小、透明度、純度及雜菌抑制情況。
4.CO?依賴型實驗：
從-70℃冰箱中取出4株淋球菌參考菌株（ATCC49226、WHOG、WHOJ、WHOL）及12株臨床分離株（NJ08-92、NJ08-94、NJ08-99、NJ08-100、NJ08-101、NJ08-102、NJ08-104、NJ08-105、NJ08-106、NJ08-112、NJ08-117、NJ08-118），分別取出10μl標本平行接種于2塊淋球菌培養(yǎng)基，置于燭缸內(nèi)（含CO?）和燭缸外（不含CO?）的培養(yǎng)箱中，36℃培養(yǎng)36 h，觀察兩組菌落生長情況。依據(jù)全國臨床檢驗操作規(guī)程判定菌落生長情況，“+”：1～10個菌落（稀疏生長）；“++”：11～100個菌落（中等生長）；“+++”：>100個菌落，但未融合（密集生長）；“++++”：菌落融合成片（無法計數(shù)）。
5.保存液效果比較：
4種淋球菌保存液分別為10%二甲基亞砜小牛血清（二甲基亞砜與小牛血清1:9）、10%甘油小牛血清（甘油與小牛血清1:9）、20%甘油腦心浸液（3.7%腦心浸液與甘油4:1）、30%甘油胰酶大豆肉湯（專利申請?zhí)枺?025107655801），根據(jù)各自特點進行配制，將待測的4株參考菌株（ATCC49226、WHOG、WHOJ、WHOL）和4株臨床分離株（NJ08-91、NJ08-93、NJ08-107、NJ08-136）分離純化后，制成1×10?CFU/ml菌懸液，置于不同保存液中，各分裝數(shù)支，分別置于-20℃和-70℃的冰箱中，定期取出10μl接種于淋球菌培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)36 h，觀察菌落生長情況。
6.保存方法效果比較：
參考菌株WHOJ分離純化后，制成1×10?CFU/ml的菌懸液，置于滅菌的10%脫脂牛奶中，分裝數(shù)支，將凍干和未凍干的淋球菌分別置于4℃、-18℃、-29℃、-70℃和液氮環(huán)境中保存，定期分別取出10μl接種于淋球菌培養(yǎng)基36℃培養(yǎng)36 h，觀察淋球菌的存活情況。
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