基于可培養(yǎng)技術(shù)的古象牙病害微生物分離鑒定與抑菌劑篩選評(píng)價(jià)（一）
摘要
為科學(xué)有效防控三星堆出土古象牙的微生物病害，采用可培養(yǎng)技術(shù)對(duì)三星堆出土古象牙殘片表面滋生的細(xì)菌和真菌進(jìn)行分離鑒定，并測(cè)定苯扎氯銨、苯并咪唑、制霉菌素、三氯生、特泯菌5種抑菌劑對(duì)微生物的最小抑菌濃度(MIC)，分析抑菌效果，確定科學(xué)的使用劑量。通過(guò)可培養(yǎng)方法從三星堆古象牙殘片上分離出4株分屬于4個(gè)屬的細(xì)菌，分離出29株分屬于3個(gè)門(mén)16個(gè)屬的真菌，其中子囊菌門(mén)(Ascomycota)7個(gè)屬、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycotina)7個(gè)屬以及半知菌門(mén)(Deuteromycetes)2個(gè)屬。抑菌結(jié)果表明，除苯并咪唑外，其他4種抑菌劑的抑菌濃度雖然存在差異，但在一定濃度范圍內(nèi)都能達(dá)到完全抑菌的效果。苯扎氯銨、三氯生、特泯菌能夠抑制所有細(xì)菌生長(zhǎng)的MIC分別為64、256、8 mg/L，在復(fù)配處理中，3種抑菌劑苯扎氯銨(MIC 16 mg/L)、三氯生(MIC 64 mg/L)、特泯菌(MIC 2 mg/L)兩兩隨機(jī)復(fù)配均能達(dá)到完全抑菌效果；苯扎氯銨、三氯生、制霉菌素能夠抑制所有真菌生長(zhǎng)的MIC分別為8000、400、400 mg/L，在復(fù)配處理中，制霉菌素與苯扎氯銨MIC分別為200、4000 mg/L時(shí)復(fù)配能完全抑制所有供試真菌的生長(zhǎng)?？梢?jiàn)，三星堆出土古象牙表面分布著種類(lèi)豐富的微生物，不同抑菌劑對(duì)不同種類(lèi)微生物的抑制效果存在差異，復(fù)配抑菌劑的抑菌效果優(yōu)于單一菌劑；結(jié)果可為三星堆出土古象牙微生物病害防治和古象牙保護(hù)工作提供科學(xué)依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1樣品采集
三星堆古象牙殘片出土后被保存在墊有網(wǎng)狀海綿的塑料盒子中保藏，以出土于K5坑表面滋生有微生物的古象牙殘片樣品為研究對(duì)象，采用無(wú)菌棉簽對(duì)古象牙殘片已長(zhǎng)菌或出現(xiàn)明顯色變的位置進(jìn)行擦拭，并放置于無(wú)菌Eppendorf管中，保存于冰盒，立刻帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)研究。
1.1.2培養(yǎng)基及主要試劑與儀器
?培養(yǎng)基:PDA(potato dextrose agar)、TSA(tryptone soy agar)、MHA(Mueller-Hinton agar)，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。
?主要試劑:真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、PCR引物、瓊脂糖、制霉菌素、苯并咪唑、三氯生、特泯菌，生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR mix,天根生化科技(北京)有限公司；核酸染料Redgeld,BBI生命科學(xué)有限公司；無(wú)水乙醇，成都市科隆化學(xué)品有限公司；苯扎氯銨，成都貝斯特試劑有限公司。
?主要儀器:超景深顯微鏡VHX7000，日本基恩士KEYENCE公司；光學(xué)顯微鏡，ZEISS公司；冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、凝膠成像儀，Bio-Rad公司；DKT200-4恒溫金屬浴，杭州米歐儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，鄭州生元儀器有限公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，BBI生命科學(xué)有限公司；oCelloScope 微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)量?jī)x，丹麥Biosense公司。
1.2方法
1.2.1古象牙殘片表面微生物觀察
將裝古象牙殘片的塑料盒子直接放于超景深顯微鏡載物臺(tái)上，于30x和200x的放大倍數(shù)下觀察古象牙殘片表面微生物形態(tài)并拍攝照片。
1.2.2菌株培養(yǎng)與純化
分別采用TSA和PDA培養(yǎng)基分離古象牙表面滋生的細(xì)菌和真菌，將采集的樣品在分離培養(yǎng)基上均勻涂布，每組重復(fù)3次。涂布后的PDA平板置于25°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-5 d，TSA平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3 d。待菌落長(zhǎng)出后，挑取具有不同菌落特征的菌株進(jìn)行純化，并用斜面試管和甘油管進(jìn)行菌種保藏。
1.2.3菌株形態(tài)觀察及系統(tǒng)發(fā)育分析
?菌株形態(tài)學(xué)觀察:將分離獲得的細(xì)菌接種于TSA平板上28°C恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的顯微形態(tài)；將真菌接種于鋪有無(wú)菌玻璃紙(3 cm x 3 cm)的PDA平板上，25°C恒溫培養(yǎng)5 d，觀察菌落的顏色、大小、菌絲生長(zhǎng)狀況，并用剪刀剪取長(zhǎng)有菌的一小塊玻璃紙邊緣在50%的乙醇中漂洗5 s后將有菌面朝上置于載玻片上，滴加棉蘭染色液后蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲以及孢子形態(tài)。
?DNA提取及系統(tǒng)發(fā)育分析:采用Cui等的方法提取細(xì)菌的DNA，采用30μL反應(yīng)體系，以16S rRNA的通用引物8-27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAAC GAACGCT-3')和1492-1523R(5'-TACGG CTACCTTGTT-ACGACTT CATCACCC-3')對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將長(zhǎng)滿(mǎn)真菌菌絲的3 cm x 3 cm玻璃紙取出放置于2 mL的Eppendorf管中，用液氮快速冷凍研磨粉碎，用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒按照說(shuō)明操作提取真菌DNA。采用30μL反應(yīng)體系，以ITS的引物ITS1F(5'-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3')和ITS4R(5'-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3')對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至杭州有康生物科技有限公司成都分公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中利用BLAST進(jìn)行比對(duì)，找出與目標(biāo)菌株同源性較高的16S rRNA/ITS序列，用MEGA7.0軟件通過(guò)鄰近法構(gòu)建目標(biāo)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定其分類(lèi)地位。
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