梅花鹿體細胞航天誘變、細胞樣品回收培養(yǎng)技術、生長曲線及核型特性（一）
摘要：本研究以自主研發(fā)的聚偏二氟乙烯膜（PVDF）細胞培養(yǎng)技術進行了梅花鹿（Cervus nippon）體細胞的航天培養(yǎng)及生物誘變，并分析了其細胞在航天誘變后的生長曲線和核型特性。采用耳緣皮膚組織塊貼壁培養(yǎng)的方法進行體細胞的原代培養(yǎng)；胰蛋白酶消化的方法完成細胞的傳代培養(yǎng)；依照程序降溫的方法完成細胞的冷凍保存；每天計數(shù)24孔板每孔的活細胞數(shù)并利用Excel 97-2003繪制出細胞的生長曲線，采用IBM SPSS Statistics 23統(tǒng)計軟件回歸分析程序中的非線性回歸分析子程序Logistic曲線模型分析細胞生長曲線的擬合度；以常規(guī)染色體標本制備技術，利用細胞遺傳工作站（AI）軟件對梅花鹿體細胞的染色體核型進行分析。
實驗結(jié)果表明，新開發(fā)的PVDF膜細胞培養(yǎng)技術可有效保持梅花鹿體細胞在太空飛行過程中的存活并成功回收、傳代建系。通過細胞傳代培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，該體細胞經(jīng)航天誘變后保持正常的成纖維細胞特征，生長曲線呈“S”型，航天誘變組體細胞在培養(yǎng)4 d進入對數(shù)生長期，與對照組體細胞在培養(yǎng)2 d進入對數(shù)生長期相比其細胞增殖速度減慢。擬合生長曲線分析表明，航天誘變組細胞生長擬合度值與對照組相似，但細胞增殖拐點時間、拐點細胞量分析結(jié)果證明，航天誘變后的體細胞增殖速度減慢。核型分析顯示，航天誘變梅花鹿體細胞染色體數(shù)保持2n=66，染色體形態(tài)正常，核型為66（XX），其中32對常染色體，1對性染色體。本研究建立了哺乳動物在航天運行條件下的細胞培養(yǎng)PVDF新技術，并分析了航天誘變對于梅花鹿細胞生物學特性變化的影響，為以后進行相關研究提供了基礎信息和技術支持。
梅花鹿（Cervus nippon）主要分布在亞洲東部，是東亞季風區(qū)特產(chǎn)的珍貴經(jīng)濟動物之一，已列為國家Ⅰ級重點保護野生動物。梅花鹿屬于哺乳綱（Mammdia）偶蹄目（Artiodactyla）鹿科（Cervide）花鹿屬。在公元前14世紀至公元前12世紀中國就開始對野生梅花鹿進行馴養(yǎng)化利用，是世界上最早養(yǎng)殖梅花鹿的國家。我國作為目前世界上僅有的3個（美國、俄羅斯、中國）掌握返回式衛(wèi)星技術的國家之一，近些年來在航天生物育種領域取得了一系列開創(chuàng)性研究成果。2016年4月6日凌晨升空的“實踐十號”衛(wèi)星，搭載了來自內(nèi)蒙古賽科星家畜種業(yè)與繁育生物技術研究院提供的牛（Bos taurus）、綿羊（Ovis aries）、梅花鹿等大型動物和野生動物的體細胞（somatic cell）、精子（sperm）等材料，這是我國首次在太空進行大型動物航天生物誘變實驗。
本研究以雌性梅花鹿體細胞為材料，開發(fā)了哺乳動物體細胞在太空的培養(yǎng)新技術，與對照組比較分析了航天誘導的梅花鹿體細胞的細胞生長、染色體變化等生物學特性，為動物的航天生物育種技術建立提供了基礎資料和相關信息。本研究同時對于豐富我國動物品種資源庫、提升梅花鹿產(chǎn)業(yè)競爭力具有重要戰(zhàn)略性意義。
1材料與方法
1.1實驗材料
2016年3月在內(nèi)蒙古賽科星家畜種業(yè)與繁育生物技術研究院實驗基地選取19月齡健康的雌性梅花鹿，編號為NCH32，剪取其耳緣皮膚組織用于實驗。
1.2雌性梅花鹿NCH32成纖維細胞系的建立
剪取雌性梅花鹿NCH32的耳緣皮膚組織約1 cm2，用手術刀片剔除耳毛，并用含有青霉素和鏈霉素雙抗的PBS清洗3次，24 h內(nèi)送回實驗室進行原代細胞建系培養(yǎng)。在超凈工作臺中，用75%酒精浸泡采取的組織樣品30 s，再用Dulbecco磷酸鹽緩沖液（Dulbecco′s phosphate buffered saline，DPBS）（GIBCO公司）沖洗3次，用手術刀片剔除皮膚間的結(jié)締組織，將其剪成1 mm3左右的小塊，用無菌玻璃管將組織碎塊均勻分布于培養(yǎng)瓶中，加入5 ml含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（GIBCO公司）的MEM-Alpha（1×）（α-MEM）培養(yǎng)液（GIBCO公司），在37.5℃、5%CO?的培養(yǎng)箱（RS Biotech 311）中倒置培養(yǎng)4~6 h后，正置培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)12 d以后，耳皮成纖維細胞生長至約90%匯合度時，按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。棄去原有培養(yǎng)液，用DPBS沖洗細胞后，加入0.25%胰蛋白酶（Sigma公司）消化2~3 min。細胞脫壁后加入含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液終止消化。離心并收集細胞，按照1︰3比例分瓶傳代培養(yǎng)。成纖維細胞傳至6~8代時用于染色體標本制備。
1.3梅花鹿體細胞的航天培養(yǎng)方法
根據(jù)實驗經(jīng)費和實驗材料的特殊性，此次實驗按照本實驗室自主研發(fā)的新型成纖維細胞在太空環(huán)境的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）培養(yǎng)方法，將梅花鹿體細胞搭載于實踐10號返回式科學實驗衛(wèi)星上，并在太空中飛行12 d后進行回收、培養(yǎng)和保存。具體實驗方法參照用于航天生物育種的家畜成纖維細胞培養(yǎng)方法（內(nèi)蒙古賽科星家畜種業(yè)與繁育生物學技術研究院有限公司2016），實驗流程見圖1。
1.3.1培養(yǎng)基配制
實驗中共使用了2種培養(yǎng)基，具體配制方法如下。
1×液體培養(yǎng)基：5 ml胎牛血清（FBS），0.5 ml青霉素/鏈霉素雙抗，用MEM-Alpha（1×）培養(yǎng)液定容至50 ml。
瓊脂固體培養(yǎng)基：首先配制1%瓊脂，稱取5.0 g瓊脂并加入50 ml蒸餾水，微波爐加熱融化后，進行高壓滅菌。之后配制2×液體培養(yǎng)基：20 ml胎牛血清（FBS），1 ml青霉素/鏈霉素雙抗，1 ml非必須氨基酸（essential amino acid，NEAA），用2×MEM定容至50 ml。最后，將1%瓊脂滅菌后冷卻至40℃左右，與38℃預熱的2×液體培養(yǎng)基按1︰1混合配制成0.5%瓊脂固體培養(yǎng)基。