貝氏柯克斯體在高滲脫水環(huán)境中的生物學(xué)特性研究（三）
2.3高滲壓脫水的貝氏柯克斯體感染性VFU值的對(duì)比測(cè)定
研究表明,環(huán)境野生型與實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的貝氏柯克斯體對(duì)真核細(xì)胞的感染性不同,基于無(wú)生命培養(yǎng)基高滲壓脫水后的菌體對(duì)真核細(xì)胞的感染性未知。因此,我們通過(guò)qPCR定量并調(diào)整NMII10×NaCl、NMII、NMII1/100×NaCl菌體拷貝一致后,利用相差顯微鏡計(jì)數(shù)高滲脫水所得菌體NMII10×NaCl感染BGMK細(xì)胞的VFU值,可見(jiàn)在感染后24 h高滲透壓組菌體NMII10×NaCl的VFU較常規(guī)組NMII、低滲透壓組NMII1/100×NaCl的VFU無(wú)顯著改變。在感染后96 h,NMII10×NaCl的VFU對(duì)比感染后24 h未見(jiàn)明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng),這與NMII及NMII1/100×NaCl在感染后96 h VFU的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)顯著不同。值得注意的是,在感染后144 h,NMII10×NaCl的VFU對(duì)比感染后96 h的VFU值增加,同時(shí)與NMII有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-2.11,P<0.05),這提示可能與菌體經(jīng)高滲脫水處理后在胞內(nèi)的適應(yīng)性生長(zhǎng)有關(guān),如圖3所示。
圖3滲透壓梯度培養(yǎng)后的貝氏柯克斯體感染BGMK細(xì)胞的VFU值
2.4透射電子顯微鏡對(duì)比分析貝氏柯克斯體菌體形態(tài)
在自然環(huán)境中,貝氏柯克斯體以耐干燥脫水且具備感染性的I相菌體廣泛存在,形態(tài)類似于雙相發(fā)育周期中直徑小于1μm的小貝氏體(SCVs)。然而在實(shí)驗(yàn)室研究中,典型雙相發(fā)育周期中的大貝氏體(LCVs)直徑多大于0.5μm。使用透射電子顯微鏡觀察貝氏柯克斯體NMII10×NaCl、NMII、NMII1/100×NaCl在無(wú)生命培養(yǎng)環(huán)境中的形態(tài)學(xué)變化,可見(jiàn)脫水條件下,菌體成簇生長(zhǎng),直徑大多小于1μm,菌體類似脫水皺縮的表面結(jié)構(gòu)。在低滲壓組中,菌體直徑大多1μm以上,形態(tài)類似于表面飽滿的球桿狀,對(duì)比可見(jiàn)NMII直徑約為1μm的典型菌體結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分別將NMII10×NaCl、NMII、NMII1/100×NaCl感染BGMK細(xì)胞后培養(yǎng)7 d,使用透射電鏡觀察可見(jiàn)3組菌體均可感染并在胞質(zhì)內(nèi)形成CCV囊泡,且囊泡直徑無(wú)明顯差別,同時(shí)菌體在CCV囊泡內(nèi)呈典型的雙相發(fā)育菌體形態(tài)。這提示與無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的發(fā)育周期不同,菌體在胞內(nèi)的繁殖環(huán)境有利于菌體的典型雙相發(fā)育,如圖4所示。
圖4貝氏柯克斯體形態(tài)的電子顯微鏡對(duì)比分析
注:A、D為NMII10×NaCl;B、E為NM;C、F為NMII1/100×NaCl,均為培養(yǎng)后第7 d。
3討論
貝氏柯克斯體作為一種經(jīng)氣溶膠傳播的烈性傳染病原體,具有極強(qiáng)的感染能力與環(huán)境抵抗力。一直以來(lái),由于該病原自身的胞內(nèi)寄生繁殖特性以及缺乏無(wú)生命克隆純化技術(shù),關(guān)于貝氏柯克斯體的環(huán)境耐受性機(jī)制研究進(jìn)展緩慢。近年來(lái),無(wú)生命培養(yǎng)方法的研制不僅部分解決了貝氏柯克斯體克隆純化的難題,而且為該菌的基因編輯提供了技術(shù)支撐,同時(shí)ACCM培養(yǎng)基組分的可量化調(diào)整有助于實(shí)驗(yàn)室模擬外界脫水條件,從而進(jìn)一步探究貝氏柯克斯體的環(huán)境抵抗特性遺傳機(jī)制。
脫水是細(xì)菌失活的主要方式之一,本研究以無(wú)生命培養(yǎng)系統(tǒng)為技術(shù)平臺(tái),成功建立了滲透壓梯度的貝氏柯克斯體脫水研究模型,為后續(xù)探究菌體耐脫水相關(guān)蛋白表達(dá)以及對(duì)應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平打下了基礎(chǔ)。我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)貝氏柯克斯體NMII可在高達(dá)3 500 mOsm/L滲透壓脫水的無(wú)生命培養(yǎng)基中適應(yīng)性存活,而在低滲透壓條件下可獲得有限生長(zhǎng),這不僅說(shuō)明菌體可在無(wú)生命環(huán)境中抵抗脫水,也驗(yàn)證了Na+與Cl-是無(wú)生命培養(yǎng)體系中實(shí)現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)的重要組分。另外在細(xì)胞感染及生長(zhǎng)特性方面,在感染后96 h,經(jīng)脫水后NMII10×NaCl的VFU顯著低于NMII,而低滲透壓培養(yǎng)的NMII1/100×NaCl與NMII在感染后96 h的VFU差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但在感染后144 h,經(jīng)高滲脫水后NMII10×NaCl的VFU仍較前增加,僅與NMII有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-2.11,P<0.05)。這提示脫水處理后的菌體感染BGMK細(xì)胞后的適應(yīng)性生長(zhǎng)過(guò)程可能較野生型延長(zhǎng),同時(shí)提示上述感染及適應(yīng)性生長(zhǎng)特性改變可能與菌體生長(zhǎng)環(huán)境中的滲透壓變化所致自身相關(guān)蛋白表達(dá)水平有關(guān),結(jié)合菌體在透射電子顯微鏡下的形態(tài)變化,這提示這些蛋白的表達(dá)水平變化很可能影響菌體的雙相發(fā)育。
貝氏柯克斯體自然野生株的獲取及克隆制備是本領(lǐng)域的技術(shù)難題,一直以來(lái)缺乏實(shí)驗(yàn)室研究模型,本研究成功培養(yǎng)制備了脫水存活的貝氏柯克斯體菌株,為進(jìn)一步在蛋白質(zhì)組及基因水平分析該病原耐受脫水的遺傳機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)性基礎(chǔ)。
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