脂肽對蜜蜂球囊菌生長抑制作用及其孢子萌發(fā)的影響（一）
摘要
目的:探究脂肽對蜜蜂球囊菌的抑制作用和機(jī)制，以及其體外抑菌和殺菌活性。方法:通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法鑒定蜜蜂球囊菌，采用抑菌圈試驗(yàn)法驗(yàn)證脂肽能否抑制蜜蜂球囊菌生長，采用倍比稀釋法測定脂肽對蜜蜂球囊菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺真菌濃度(MFC)。采用BioSense微生物快速立體計(jì)數(shù)儀觀察脂肽對蜜蜂球囊菌孢子萌發(fā)的影響;高效液相色譜法測定蜜蜂球囊菌細(xì)胞膜中麥角甾甾醇和細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)含量，確定脂肽Iturin對蜜蜂球囊菌是否存在抑制作用。
結(jié)果:顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分離菌菌絲呈有隔膜的分枝狀和具有球形的孢子囊、孢子等形態(tài)。18S rDNA測序結(jié)果顯示，分離菌與蜜蜂球囊菌(GenBank登錄號:GQ867785.1)序列相似性為100%，確定獲得的菌株為蜜蜂球囊菌。脂肽伊枯草菌素(Iturin)對蜜蜂球囊菌的抑制作用最好，抑菌圈半徑達(dá)8.53mm，豐原素(Fengycin)抑菌圈半徑為5.84mm，表面活性素(Surfactin)無抑制作用。Iturin對蜜蜂球囊菌的MIC為6.25~25μg/mL,MIC??、MIC??和MFC分別為6.25、25和50μg/mL。與0μg/mL Iturin處理組相比，6.25、12.5、25和50μg/mL Iturin處理組蜜蜂球囊菌孢子萌發(fā)率均顯著下降(P<0.05)。麥角甾甾醇含量測定結(jié)果顯示，與0μg/mL Iturin處理組相比，12.5、25和50μg/mL Iturin處理組蜜蜂球囊菌細(xì)胞膜麥角甾甾醇含量均顯著下降(P<0.05)。幾丁質(zhì)含量測定結(jié)果顯示，與0μg/mL Iturin處理組相比，25和50μg/mL Iturin處理組蜜蜂球囊菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量顯著下降(P<0.05)。結(jié)論:脂肽Iturin通過減少孢子萌發(fā)，破壞細(xì)胞膜中麥角甾甾醇的生物合成及損害細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的合成來有效抑制蜜蜂球囊菌。
1材料與方法
1.1材料
?菌株:蜜蜂球囊菌源自患白堊堊病蜜蜂幼蟲，經(jīng)純化培養(yǎng)所得，患病蜜蜂幼蟲由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所提供。
?主要試劑和儀器:Surfactin、PI染液均購自上海源葉生物科技有限公司;Fengycin購自南京翼飛雪生物科技有限公司;Iturin購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司;麥角甾甾醇標(biāo)準(zhǔn)品購自北京百靈威科技有限公司;甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;D(+)-氨基葡萄糖鹽酸鹽購自上海麥克林生化科技有限公司;氯甲酸-9-芴基、甲酯(FMOC-CL)均購自北京華威銳科化工有限公司;真菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)購自北京奧博星生物科技有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。硼酸鈉溶液配制:稱一定量的硼酸，用NaOH將pH調(diào)至中性，并使其濃度為0.2mol/L。脂肽溶液的配制:將脂肽Surfactin、Fengycin、Iturin分別溶于甲醇溶液中使其濃度為1mg/mL，備用。
生化培養(yǎng)箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;生物安全柜購自NuAire公司;PCR儀購自杭州博日科技有限公司;凝膠成像分析儀購自杭州米歐儀器有限公司;液相色譜儀購自安捷倫科技有限公司;激光共聚焦顯微鏡和體式顯微鏡均購自徠卡公司;BioSense微生物快速立體計(jì)數(shù)儀購自丹麥BioSense公司;光學(xué)顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司;滅菌鍋、電子天平、烘干箱、離心機(jī)、測微尺。
1.2方法
1.2.1分離菌形態(tài)學(xué)鑒定
分離菌顯微觀察及測量:將純化菌株產(chǎn)生的黑色子實(shí)體和白色菌絲分別置于載玻片上并滴一滴無菌水，混合均勻，蓋上蓋玻片，在體式顯微鏡下進(jìn)行觀察，在普通光學(xué)顯微鏡下用測微尺測量其大小，取4組球囊菌，每組重復(fù)測定3次。
1.2.2分離菌分子生物學(xué)鑒定
用真菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌DNA，設(shè)計(jì)真菌通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',PCR擴(kuò)增18S rDNA，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照戚偉等方法。PCR反應(yīng)體系50μL:2xTaq Master Mix(Dye)25μL,模板DNA 1μL,上、下游引物(10μmol/L)各2μL,ddH?O 20μL。PCR反應(yīng)程序:98℃預(yù)變性2min;98℃變性10s,54℃退火70s,72℃延伸10s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察結(jié)果,并將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。
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