棘孢木霉TCS007菌株的固態(tài)發(fā)酵條件、次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量影響因素（一）
植物病原真菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主要威脅之一，不僅會(huì)導(dǎo)致作物減產(chǎn)，還可能引發(fā)嚴(yán)重的病害流行，給全球糧食安全帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌劑雖然在防治植物病害方面發(fā)揮了重要作用，但其長(zhǎng)期使用也導(dǎo)致了病原菌抗藥性的增加，對(duì)環(huán)境和人類健康造成負(fù)面影響。因此，開(kāi)發(fā)環(huán)境友好、高效、低殘留且可持續(xù)的生物防治方法成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
木霉屬(Trichoderma)真菌是一類廣泛存在于土壤中的有益微生物，具有廣譜的抑菌活性，能夠抑制多種植物病原真菌的生長(zhǎng)。近年來(lái)，木霉及其代謝產(chǎn)物在生物防治中的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。棘孢木霉(Trichoderma asperellum)作為木霉屬中的一種，已被證明其代謝產(chǎn)物中含有多種具有生物活性的次生代謝物，如木霉菌素、吡喃酮類化合物等，其中的6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-pentyl-2-pyrone)對(duì)植物病原真菌具有顯著的抑制作用，并且還能夠誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)。
不同微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境各異，根據(jù)微生物的生長(zhǎng)特性，需要采用特定的培養(yǎng)基，因此，篩選優(yōu)化培養(yǎng)基組分與培養(yǎng)條件是實(shí)現(xiàn)微生物源藥劑最大化生產(chǎn)的必要步驟。固態(tài)發(fā)酵(solid-state fermentation，SSF)是一種利用固體基質(zhì)進(jìn)行微生物發(fā)酵的技術(shù)，具有成本低、操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)物濃度高等優(yōu)點(diǎn)。與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵更有利于木霉菌的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累。固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)在為微生物提供碳、氮、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，還可為微生物生長(zhǎng)及代謝提供載體。通過(guò)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件，可以顯著提高木霉菌的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量及其抑菌活性。響應(yīng)曲面法(response surface methodology，RSM)可用于研究多個(gè)影響因素之間的相互作用，同時(shí)預(yù)測(cè)變量的最佳值，是微生物發(fā)酵優(yōu)化中常用的準(zhǔn)確高效的方法之一。
棘孢木霉菌株由本研究團(tuán)隊(duì)分離自南極海洋沉積物(菌株號(hào)：HTTA-Z0002)，經(jīng)誘變穩(wěn)定后鑒定并命名為棘孢木霉TCS007(T.asperellum TCS007)菌株，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC No.15677，菌株及其功能首次公布于中國(guó)發(fā)明專利ZL 201810935616.6和ZL 201810936028.4。前期研究已明確，TCS007菌株對(duì)油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)和黃瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)等多種植物病原菌均有較好的抑制效果，并且發(fā)現(xiàn)其液體發(fā)酵濾液稀釋10倍及粗提發(fā)酵產(chǎn)物(crude fermentation extracts，CFE)在10 mg/L質(zhì)量濃度下對(duì)油菜菌核病菌的抑制率均可達(dá)到95%，由此推測(cè)其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中含有活性較強(qiáng)的抑菌物質(zhì)。此外，TCS007菌株能誘導(dǎo)向日葵產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，防治由核盤菌引起的向日葵菌核病，還能誘導(dǎo)蠶豆、黃瓜和水稻對(duì)干旱、低溫和鹽堿的耐受性?？梢?jiàn)，TCS007菌株作為生物農(nóng)藥和生物肥料都具有廣闊的應(yīng)用前景。前期研究表明，大米固態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵所得次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量明顯高于液體培養(yǎng)基發(fā)酵。本研究旨在通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法，進(jìn)一步優(yōu)化棘孢木霉TCS007菌株的固態(tài)發(fā)酵條件，以期提高其次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，并探究其代謝粗提產(chǎn)物對(duì)油菜菌核病菌等植物病原真菌的抑制活性，為棘孢木霉TCS007菌株后續(xù)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的發(fā)酵工藝確定和實(shí)際應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料與儀器
1.1.1供試菌株
生防真菌：棘孢木霉TCS007(T.asperellum TCS007)菌株由浙江農(nóng)林大學(xué)綠色農(nóng)藥協(xié)同創(chuàng)新中心分離，于?80℃冰箱中保存，備用。
植物病原真菌：油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、蘋果褐斑病菌(Marssonina coronaria)、黃瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、果生刺盤孢(Colletotrichum fructicola)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、草坪幣斑病菌(Sclerotinia homoeocarpa)、玉米彎孢葉斑病菌(Curvularia lunata)，均由本實(shí)驗(yàn)室分離、保存和鑒定。
1.1.2培養(yǎng)基
PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水補(bǔ)至1 L，121℃滅菌15 min。
初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：300 mL三角瓶中加入大米72 g，蒸餾水48 mL，121℃滅菌15 min。
1.1.3藥劑及試劑
97.5%啶酰菌胺(boscalid)原藥，浙江宇龍生物科技有限公司提供。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、無(wú)水Na2SO4、HCl、NaOH、NaCl、MnSO4、MgSO4、CaCl2、FeCl3和尿素均為分析純。
1.1.4主要儀器
BSA233S電子精密天平(精確到0.001 g，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；MLS-3751L-PC高壓蒸汽滅菌鍋(松下健康醫(yī)療器材有限公司)；MJ-150-I霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DHG-9030A臺(tái)式鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；μCount3D立體計(jì)數(shù)儀(丹麥BioSense公司)；Axio Lab.A1 pol光學(xué)顯微鏡(歐波同有限公司)。
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