植物乳桿菌發(fā)酵紅棗汁的理化特性演變與總酚生成動力學(xué)分析（二）
1.3.3活菌數(shù)和理化指標(biāo)測定
1.3.3.1活菌數(shù)測定
采用BioSense微生物快速立體計數(shù)儀測定活菌數(shù)。具體步驟如下：準(zhǔn)確吸取1 mL發(fā)酵紅棗汁樣品，用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇2-3個適宜的稀釋梯度。取100μL稀釋液與配套的熒光染料染色液充分混合，避免光孵育15分鐘。隨后將混合液全部加入檢測芯片的加樣孔中，將芯片放入儀器進(jìn)行檢測。儀器自動對熒光染色的活菌進(jìn)行三維立體計數(shù)，結(jié)果直接以lgCFU/mL顯示。
1.3.3.2可滴定酸含量測定
參考石彬等的方法并略作修改。精確吸取5mL發(fā)酵紅棗汁樣品至25mL離心管中，加水稀釋至刻度線后搖勻。取一定量的樣液，加入酚酞指示劑5～10滴，用0.1mol/L的ΔNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定?？傻味ㄋ岷坑嬎愎饺缦拢?
可滴定酸含量（%）=cXuXk
式中：c為ΔNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/L;k為折算系數(shù)0.090：v為消耗ΔNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;v0為滴定用樣液的體積，mL v1為試樣的體積，mL；25為樣品提取液的總體積，mL。
1.3.3.3總糖含量測定
參照于梅等的方法。以葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.5846x+0.199 8，R2=0.991 9。按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定樣品在490nm處的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到發(fā)酵紅棗汁的總糖含量。
1.3.3.4總黃酮含量測定
參考譚榮華等的方法并稍作修改。取發(fā)酵紅棗汁樣品5mL，離心（4°C，6 000r/min，10min），取上清液備用。取上清液1mL，加入30%z醇補至6mL后混合均勻，超聲提?。?0°C.30min），加人5%（204號NaNO2溶液和10%Al（NO3）3溶液各1mL，然后加入10%NaOH溶液10mL，需注意每次加入試劑均需搖勻靜置6min，最后加入30%乙醇至25mL，振蕩搖勻靜置15min在510nm處測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0021x+0.023 4，R2=0.996 2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到總黃酮含量。
1.3.3.5總酚含量測定
參照Turkyilmaz等的方法并稍作修改。取發(fā)酵紅棗汁樣品5mL，離心，取1mL上清液與無水乙醇混合，超聲提?。?0°C.30min），先加入去離子水5mL，再加入福林酚試劑0.5mL和15%（204號Na2CO3溶液1mL，振蕩搖勻靜置，避光反應(yīng)35min再用去離子水定容至25mL，在760nm處測定吸光度。以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.042 7x+0.039 9，R2=0.994 4根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到總酚含量。
1.3.4動力學(xué)研究
為探究菌體生物量和總酚含量在發(fā)酵過程中的變化趨勢及其相關(guān)性，以1h為間隔點，對發(fā)酵紅棗汁中菌體生物量和總酚含量進(jìn)行測定，建立二者的動力學(xué)模型并進(jìn)行驗證，以此預(yù)測菌體生長狀況及總酚含量在發(fā)酵過程中的變化。
1.3.4.1菌體生物量測定
將發(fā)酵紅棗汁樣品按一定比例稀釋，在600nm處測定菌體生物量。將測得的吸光度與稀釋倍數(shù)相乘即為菌體光密度（OD值）。
1.3.4.2菌體生長動力學(xué)模型
菌體生長變化量可以采用多種模型進(jìn)行描述，其中Logistic方程是典型的“S"形曲線，普遍適用于擬合各種菌體的生長過程。因此，可以用Logistic方程對紅棗汁發(fā)酵過程中菌體生長趨勢進(jìn)行研究。
1.3.4.3總酚含量變化動力學(xué)模型
為探索紅棗汁發(fā)酵過程中總酚含量的變化趨勢，擬采用Logistic方程、Sgompertz方程和Boltzmann方程建立總酚含量變化的動力學(xué)模型，比較模型的相關(guān)系數(shù)R2，取R2最大的模型為總酚含量變化的動力學(xué)模型。
1.4數(shù)據(jù)處理
利用Excel2021和IBMSPSS25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，采用Origin2021進(jìn)行繪圖和動力學(xué)模型建立，每組試驗重復(fù)3次。
2結(jié)果與討論
2.1活菌數(shù)
發(fā)酵紅棗汁中植物乳桿菌的活菌數(shù)變化見圖1。
圖1紅棗汁發(fā)酵過程中活菌數(shù)變化
注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），下圖同。
由圖1可知，發(fā)酵0～12h時，植物乳桿菌的活菌數(shù)呈對數(shù)增長，生長繁殖速度快，活菌數(shù)迅速增加至8.66lgCFU/mL。發(fā)酵12h后，活菌數(shù)先下降，之后植物乳桿菌在發(fā)酵紅棗汁中進(jìn)入穩(wěn)定期，這一變化趨勢可能是由于發(fā)酵后期紅棗汁中的氮源等營養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡，同時代謝產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致紅棗汁的ΔpH值發(fā)生改變，使發(fā)酵環(huán)境逐漸偏離最優(yōu)狀態(tài)，從而抑制了植物乳桿菌的生長。
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