滇黃精水提物促進羅伊氏乳桿菌生長增殖和定植的作用機制（一）
摘要
目的
研究滇黃精水提物（Polygonatum kingianum water extract，PW）對羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）1.2838增殖、群體感應(yīng)信號分子AI-2生成及抗脅迫相關(guān)基因的差異表達，揭示滇黃精水提物促進L.reuteri 1.2838增殖和定植的作用機制。
方法
將L.reuteri 1.2838在含有0.0126 g·mL-1 PW的MRS培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)，繪制生長曲線。通過Vibrio harveyi BB170生物發(fā)光法測定AI-2生成的量。采用Illumina HiSeq進行轉(zhuǎn)錄組測序后，篩選差異表達基因。分析差異基因表達情況，并采用實時熒光定量PCR驗證。
結(jié)果
經(jīng)PW孵育后L.reuteri 1.2838的增殖和AI-2生成能力提升。轉(zhuǎn)錄組測序得到425個顯著差異表達基因，其中上調(diào)253個，下調(diào)172個。經(jīng)GO和KEGG注釋分析后，與L.reuteri 1.2838增殖相關(guān)基因pdhA、pshB、dlat、dld，與產(chǎn)AI-2相關(guān)基因luxS、sec，以及與菌株抗脅迫相關(guān)基因groEL、groES、gltC的表達量均顯示出上調(diào)趨勢。
結(jié)論
PW通過影響L.reuteri 1.2838的三羧酸循環(huán)、群體感應(yīng)系統(tǒng)以及抗逆境能力，促進該菌株的增殖和定植，從而為滇黃精和羅伊氏乳桿菌的研發(fā)提供理論支持。
“食藥同源”品種中藥材滇黃精（Polygonatum kingianum Coll.Et Hemsl），具有養(yǎng)陰潤肺、補脾益氣、滋腎填精的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明滇黃精在防治代謝性疾病方面有一定效果。黃精可調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生菌的相對豐度，促進揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生來維持腸道的正常功能并降低腸道的通透性，避免脂多糖進入循環(huán)系統(tǒng)引發(fā)炎癥反應(yīng)，進而防治脂代謝紊亂[1]。
益生菌是指當(dāng)攝入量足夠時，能對宿主健康產(chǎn)生有益作用的活性微生物[2]。益生菌在腸道菌群中發(fā)揮重要作用。當(dāng)腸道菌群紊亂時益生菌能增強腸道黏膜屏障功能，抑制腸道內(nèi)有害細菌的生長，阻止病原菌的黏附和定植，從而維持腸道的微生態(tài)平衡[3]。羅伊氏乳桿菌是已報道的幾乎天然存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內(nèi)的益生菌，能調(diào)節(jié)宿主腸道菌群的平衡、降低膽固醇水平、增強免疫力、發(fā)揮抗氧化作用[4]。細菌中存在互相交流的現(xiàn)象，這種行為被稱為群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）現(xiàn)象。細菌向外分泌QS信號分子（Quorum sensing molecules，QSM），信號分子隨著細菌密度的增長而增加，當(dāng)信號分子到達閾值時，信號分子則能與受體結(jié)合并通過一系列的反應(yīng)調(diào)控生理活動[5]。Autoinducer-2（AI-2）信號分子是革蘭氏陰性細菌和陽性細菌均可分泌的自誘導(dǎo)物[6]。細菌利用AI-2群體感應(yīng)信號分子與周圍環(huán)境中的其他細菌進行信息交流，并且從AI-2分子反饋的信號來調(diào)控菌體相應(yīng)基因的表達，使得菌體更加適應(yīng)周圍環(huán)境[7]。益生菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象在調(diào)節(jié)益生菌的益生特性和環(huán)境適應(yīng)方面扮演著重要的角色，AI-2信號分子的生成能提高乳酸菌的抗脅迫能力，促進細菌生物膜的形成，提高細菌的黏附能力[4]。
課題組前期研究發(fā)現(xiàn)滇黃精水提物在一定程度上能提高L.reuteri 1.2838在胃腸道脅迫條件下AI-2的生成量[4]，研究表明AI-2的產(chǎn)生能夠促進益生菌的增殖和定植，進而有助于益生菌成為腸道中的優(yōu)勢菌群并調(diào)節(jié)腸道菌群失衡，從而改善宿主的糖脂代謝紊亂[8]。然而，目前關(guān)于PW提升L.reuteri 1.2838增殖和定植能力的具體作用機制尚未得到明確闡釋，因此進一步分析PW對L.reuteri 1.2838增殖、定植作用的影響，挖掘通路中涉及的相關(guān)基因并闡釋其作用機制，對研究與開發(fā)PW及L.reuteri 1.2838具有重要意義。本實驗擬通過轉(zhuǎn)錄組測序分析滇黃精水提物對L.reuteri 1.2838生長和群體感應(yīng)信號分子AI-2生成量的影響，揭示了菌株生長和產(chǎn)AI-2的關(guān)鍵基因，為滇黃精和羅伊氏乳桿菌的開發(fā)提供理論依據(jù)。
1材料
1.1菌種
益生菌Lactobacillus reuteri 1.2838購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。報告菌株哈維氏弧菌Vibrio harveyi BB170（菌種編號BNCC337376）購買于北京北納生物有限公司。
1.2試劑
滇黃精購買于云南省文山壯族苗族自治州文山市圣農(nóng)道地藥材有限公司，該藥材經(jīng)趙榮華教授鑒定為百合科植物滇黃精Polyonatum kingianum Coll.et Hemsl的根莖。2.5 L圓底立式厭氧培養(yǎng)袋、2.5 L厭氧產(chǎn)氣袋購自青島海博生物技術(shù)有限公司。MRS培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。2216E培養(yǎng)基購自青島海博微生物技術(shù)有限公司。MJZol總RNA提取試劑盒，RNA純化試劑盒購自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。
1.3儀器
垂直流潔凈工作臺（HCB-1300V）（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）。恒溫搖床（ZHWY111B）（北京瑞爾欣德科技有限公司）。冷凍離心機（H1750R）（湖南湘儀有限公司）。冷凍干燥機（FD5-3）（美國SIM公司）。全波長掃描多功能酶標(biāo)儀（VARIOSKAN FLASH）（美國Thermo公司）。NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）。Agilent 5300生物分析儀（美國Agilent公司）。Qubit 4.0熒光定量儀（美國Thermo公司）。T100 Thermal CyclerPCR儀（美國BIO-RAD公司）。NovaSeq 6000測序儀（美國illumina公司）。
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