鴨瘟病毒基因缺失株rDEV-ΔVP26生長曲線、蝕斑面積及免疫原性分析（一）
摘要
為研究鴨瘟病毒(duck enteritis virus，DEV)UL35基因缺失DEV疫苗株的生物學(xué)特性和對強毒株攻擊的免疫保護效果，本研究在鴨瘟病毒疫苗株感染性克隆pDEV-EF1基礎(chǔ)上，通過“Red E/T兩步重組”技術(shù)，構(gòu)建了UL35基因缺失的pDEV-ΔVP26突變體克隆，并轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞(CEFs)獲得了重組病毒rDEV-ΔVP26，進而對重組病毒細胞生物學(xué)特性和免疫保護能力進行了評估。病毒一步生長曲線測定表明，rDEV-ΔVP26的滴度從24~84 h穩(wěn)步上升，達到峰值105.36 TCID50·0.1 mL-1。在此期間，rDEV-ΔVP26滴度較親本毒株rDEV-EF1相比有所降低。蝕斑面積測定發(fā)現(xiàn)rDEV-ΔVP26蝕斑面積較親本株rDEV-EF1減少了10.60%，說明UL35基因缺失會輕微影響病毒擴散并降低病毒滴度。動物試驗表明，1×106 TCID50的rDEV-ΔVP26對30日齡麻鴨無致病作用，且1×105 TCID50滴度的rDEV-ΔVP26免疫組在強毒株攻擊下的保護率與相同劑量的rDEV-EF1對照組一致。該研究表明，UL35為DEV復(fù)制非必需基因，且當(dāng)接種合適劑量的病毒液時，UL35缺失不影響鴨瘟病毒疫苗株的免疫保護效果。該研究為研發(fā)用于區(qū)分疫苗免疫和野毒感染的DEV鑒別診斷疫苗奠定了基礎(chǔ)。
鴨瘟病毒(duck enteritis virus，DEV)，又稱鴨皰疹病毒Ⅰ型(Anatid alphaherpesvirus 1)，屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)，ɑ皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)，馬立克病毒屬(Mardivirus)。鴨瘟病毒呈球形，直徑為160~180 nm，主要是由核心、衣殼、皮層、囊膜四個部分組成，基因組為雙股線狀DNA，長約158 kb，由長獨特區(qū)(UL)、短獨特區(qū)(US)以及內(nèi)部重復(fù)(IR)與US兩側(cè)的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)(TR)組成。DEV主要感染鴨、鵝及其他雁形目禽類，發(fā)病迅速、傳染性強、死亡率高，嚴(yán)重損害鴨養(yǎng)殖行業(yè)的經(jīng)濟損失。鴨群感染鴨瘟病毒主要臨床癥狀有體溫發(fā)熱至43℃以上、不進食、流淚、無精打采、排白色或綠色稀軟糞便、頭腫大，俗稱“大頭瘟”。剖檢結(jié)果可看到食道、直腸和泄殖腔出血、甚至形成假膜，難以剖離，肝臟有白色出血點、脾腫大等病變。疫苗接種是預(yù)防該病的重要手段，但目前實際生產(chǎn)中免疫的鴨瘟疫苗為傳統(tǒng)減毒活疫苗，誘發(fā)機體產(chǎn)生的抗體與野毒感染無法區(qū)分，亟需一種與傳統(tǒng)疫苗具有同等保護效果且控制生產(chǎn)成本的可標(biāo)記疫苗，用來開展鑒別診斷，從而用于鴨瘟的防控和凈化。
皰疹病毒基因組編碼多種蛋白參與組成病毒的核衣殼，主要由UL18、UL19、UL26、UL26.5、UL35和UL38等基因產(chǎn)物組成，其中UL35基因是皰疹病毒特定長區(qū)的基因，大小為354 bp，編碼VP26蛋白，VP26為最小衣殼蛋白，通過與主要衣殼蛋白VP5結(jié)合而位于六鄰體上，從而修飾衣殼，主要參與病毒粒子的晚期包裝。VP26對于病毒復(fù)制和組裝都是非必需的，但參與核衣殼的成熟和出芽。VP26是唯一一個不需要參與HSV-1復(fù)制的衣殼蛋白。它是病毒DNA有效包裝及病毒核衣殼蛋白正確定位所必需的，它能通過促進病毒衣殼蛋白UL25整合至病毒衣殼從而調(diào)控病毒核衣殼成熟。VP26蛋白與病毒神經(jīng)毒力相關(guān)，VP26缺失導(dǎo)致細胞培養(yǎng)中病毒滴度降低，UL35基因缺失HSV-1在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的復(fù)制受到嚴(yán)重影響，提示VP26可能與病毒從潛伏期到再激活的過程有關(guān)。
為了闡明鴨瘟病毒VP26的生物學(xué)功能和VP26基因缺失株的免疫保護效果，本研究在鴨瘟病毒全長感染性cDNA克隆的基礎(chǔ)上，采用“Red E/T兩步重組技術(shù)”刪除UL35基因，構(gòu)建了UL35基因缺失的DEV感染性克隆，并拯救獲得了基因缺失重組病毒，對重組病毒rDEV-ΔVP26的細胞生物學(xué)特性進行了研究，隨后在鴨體上對其安全性和免疫保護能力進行了評估。
1材料與方法
1.1質(zhì)粒載體、菌株和病毒株
pEPkanS質(zhì)粒由德國柏林自由大學(xué)Osterrieder N博士惠贈；E.coli DH5α、DH10B、BL21(DE3)菌株由本實驗室保存。DEV疫苗株全長感染性克隆pDEV-EF1及相應(yīng)病毒rDEV-EF1由本實驗室構(gòu)建并保存。鴨瘟病毒強毒株CHv(CVCC AV1221)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
1.2工具酶和試劑
DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Primestar DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、膠回收試劑盒購自TaKaRa(大連)公司；DMEM培養(yǎng)基購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑購自Promega公司；甲基纖維素購自Sigma公司；胎牛血清購自Gibco公司；胰酶購自Difico公司。FuturePAGETM蛋白預(yù)制膠(4%~20%)購自ACE生物技術(shù)公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自TaKaRa(大連)公司。
1.3試驗用SPF雞胚和實驗動物
9~11日齡SPF雞胚購自寧波純派農(nóng)業(yè)科技有限公司。30日齡的DEV抗體陰性麻鴨購自杭州蕭山漢朝家禽有限公司。本研究方案、程序和內(nèi)容符合涉及動物實驗研究的倫理要求，批準(zhǔn)文件號為2021ZAASLA66。
1.4 DEV UL35基因缺失突變體的構(gòu)建
采用“兩步Red E/T重組技術(shù)”構(gòu)建DEV疫苗株UL35基因缺失株。第一步Red重組以卡那霉素(Kan)抗性基因替代UL35基因序列。以引物DEV-ΔVP26-for和DEV-ΔVP26-rev擴增pEP-Kan-S質(zhì)粒模板上Kan抗性基因的DNA片段，產(chǎn)物經(jīng)膠回收后電轉(zhuǎn)化至制備的pDEV-EF1/GS1783感受態(tài)細胞，振蕩培養(yǎng)后涂布含氯霉素(CAM)和Kan的LB平板。挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，酶切和PCR篩選正確重組的克隆(pDEV-ΔVP26-Kan)進行第二次重組。第二步Red重組將pDEV-ΔVP26-Kan質(zhì)粒中的Kan抗性基因刪除。即接種pDEV-ΔVP26-Kan菌落于CAM抗性LB液體培養(yǎng)基中，待菌液出現(xiàn)輕微云霧狀時加入等量2%L-阿拉伯糖(L-Ara)，培養(yǎng)1 h后轉(zhuǎn)入42℃水浴搖床培養(yǎng)20 min，最后32℃培養(yǎng)1 h，將細菌懸液稀釋后涂布于含1%L-Ara和CAM抗性平板進行培養(yǎng)，挑取菌落同時點種于CAM和Kan平板。酶切和PCR鑒定CAM陽性和Kan陰性的菌落，篩選獲得陽性克隆pDEV-ΔVP26。
表1用于缺失DEV VP26(UL35)的引物
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