O 型口蹄疫病毒 3D 突變體重組 FMDV 的鑒定及生長曲線的測定（二）
1.4 重組病毒的拯救
測序正確的全長質(zhì)粒 rFMDV-M403A 與 rFMDV-WT 各取 2.5 μg 與 5 μL Lip3000 混合后，轉(zhuǎn)染生長至 60％～90％的單層 BHK21 細(xì)胞中（步驟見試劑盒說明），同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞作為對照。 轉(zhuǎn)染完成后，置 37 ℃、50 mL/L CO2 恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 48～72 h，每日觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）情況，約 80％～90％細(xì)胞出現(xiàn)顯著 CPE 時(shí)收獲樣品，經(jīng)－80 ℃冰箱反復(fù)凍融 2～3 次后，在 BHK21 細(xì)胞上連續(xù)傳 10 代，置－80 ℃冰箱保存病毒備用。
1.5 重組病毒的鑒定
將出現(xiàn)明顯 CPE 的重組病毒上清經(jīng)反復(fù)凍融后，用 Trizol 裂解法提取總 RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄后，用引物 FMDV-MA-mutant-F：cctgaagctcatggagaagag，F(xiàn)MDV-MA-mutant-R：gcaggtaaagtgatctgtagc 擴(kuò)增目的片段，回收后送擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測序，以鑒定重組病毒的正確性。
1.6 重組病毒的生物學(xué)特性分析
1.6.1 病毒的傳代和突變穩(wěn)定性檢測 鑒定正確的重組病毒按 5％接種量在 BHK21 細(xì)胞上連續(xù)傳至第 10 代，觀察記錄每代出現(xiàn) CPE 的時(shí)間，將第 8 代和第 10 代病毒用 Trizol 裂解法提取總 RNA，用引物 FMDV-MA-mutant-F/FMDV-MA-mutant-R 進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增片段基因，檢測確保重組病毒在傳代過程中氨基酸能穩(wěn)定突變。
1.6.2 一步生長曲線的繪制
將單層 BHK21 細(xì)胞分別接種 0.1 倍體積的第 10 代 rFMDV-M403A 與 rFMDV-WT 病毒液，吸附 1 h 后，棄去病毒液，換成新鮮培養(yǎng)基后，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，用于測定病毒滴度。 根據(jù)測定的病毒滴度結(jié)果來繪制病毒一步生長曲線。
1.6.3 乳鼠感染試驗(yàn)
1.6.3.1 乳鼠存活率試驗(yàn) 將在 BHK21 細(xì)胞上傳代穩(wěn)定的重組毒用 PBS 緩沖液進(jìn)行 1 ∶ 1 000 稀釋，經(jīng)頸背部皮下注射 2～4 日齡乳鼠，rFMDV-M403A 與 rFMDV-WT 各注射 10 只，接種量為 50 μL／只，同時(shí)設(shè)置空白對照組。 連續(xù)觀察 8 d，記錄乳鼠死亡情況，根據(jù)致死情況繪制存活率圖。
1.6.3.2 病毒在肝中的復(fù)制情況 同樣使用在 BHK21 細(xì)胞上傳代穩(wěn)定的重組病毒經(jīng) PBS 緩沖液 1 ∶ 1 000 稀釋后，經(jīng)頸背部皮下注射 2～4 日齡乳鼠，rFMDV-M403A 與 rFMDV-WT 各注射 7 只，接種量為 50 μL/ 只。 連續(xù)觀察 7 d，中途死亡的乳鼠收集肝。 當(dāng)?shù)竭_(dá)第 7 天乳鼠狀態(tài)較好，則全部安樂死并收集肝。 將肝分成 2 份，進(jìn)行病毒載量和組織病理分析。 1 份研磨后提取組織 RNA，用 RT-qPCR 方法定量肝中的病毒 RNA 量，另 1 份交由武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行組織病理分析。
2 結(jié)果
2.1 表達(dá) O 型口蹄疫 3D 蛋白的重組 FMDV 質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
根據(jù)相關(guān)研究，筆者設(shè)計(jì)了 FMDV 的 3D 蛋白第 403 位甲硫氨酸突變成丙氨酸的完整 3D 蛋白，并委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。 構(gòu)建策略見圖 1。
圖 1 O 型 FMDV 3D 蛋白中 M403 位點(diǎn)突變的全長 cDNA感染性克隆構(gòu)建策略
2.2 含突變氨基酸全長質(zhì)粒的構(gòu)建
合成的質(zhì)粒使用 BamH Ⅰ和 Not Ⅰ酶切出目的片段（3 172 bp）與載體（2 192 bp）（圖 2）。 將目的片段連接到目標(biāo)載體（pcDNA3.1）上，測序結(jié)果顯示，已成功構(gòu)建了包含突變氨基酸的全長質(zhì)粒。
圖 2 FMDV 感染性克隆 pcDNA3.1 的構(gòu)建
2.3 轉(zhuǎn)染和病毒拯救
單層 BHK21 細(xì)胞在 6 孔板中生長至 60％～90％時(shí)用于轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒 pFMDV-3D-M403A-O 和 pFMDV-WT-O 轉(zhuǎn)染至 BHK21 細(xì)胞，置 CO2 培養(yǎng)箱中 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后，細(xì)胞出現(xiàn)顯著的 CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓并脫落，成單個(gè)或葡萄狀分布，但接種 rFMDV-M403A-O 質(zhì)粒的細(xì)胞出現(xiàn) CPE 時(shí)間較晚，而對照細(xì)胞形態(tài)完好，輪廓清晰。收取病毒，經(jīng)－80 ℃冰箱反復(fù)凍融 3 次，繼續(xù)在 BHK21 細(xì)胞上傳代，直至出現(xiàn) CPE 的時(shí)間縮短，病變更加典型（圖 3）。
圖 3 突變毒株 rFMDV-M403A 和親本毒株 rFMDV-WT 在 BHK21 細(xì)胞上的 CPE 分析
2.4 重組 FMDV 的鑒定
為了鑒定重組病毒的基因組序列正確，收集傳至第 8 代和第 12 代的重組病毒 rFMDV-M403A，用 Trizol 法從轉(zhuǎn)染的 BHK21 細(xì)胞中提取總 RNA，設(shè)計(jì)特異性引物，通過 RT-PCR 分別擴(kuò)增含有第 403 位氨基酸的基因片段。 測序結(jié)果（圖 4）顯示，拯救的重組病毒的 3D 蛋白第 403 位甲硫氨酸成功突變成丙氨酸，且能夠穩(wěn)定遺傳。
圖 4 rFMDV-M403A 毒株與親本毒株 rFMDV-WT 的部分鑒定結(jié)果
A：第 12 代 rFMDV-M403A 的部分基因序列；B：第 12 代親本毒株 rFMDV-WT 的部分基因序列。
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