微量量熱法研究金銀花與灰氈毛忍冬對(duì)志賀痢疾桿菌生長(zhǎng)代謝的影響（二）
兩批金銀花和灰氈毛忍冬樣品質(zhì)量上乘。金銀花樣品來(lái)自山東平邑道地產(chǎn)區(qū)，灰氈毛忍冬來(lái)自湖南隆回道地產(chǎn)區(qū)。兩者均由中國(guó)解放軍第三〇二醫(yī)院軍事中藥研究所（北京 100039，中華人民共和國(guó)）肖小河教授鑒定。其他化學(xué)品均為分析純，來(lái)自北京化工廠（北京，中國(guó)）。
樣品制備 使用前將金銀花和灰氈毛忍冬研磨成粉末。精確稱取 1 g 粉末，用水（v/v）40 mL 連續(xù)回流提取 30 分鐘，重復(fù)兩次。合并提取液，然后蒸發(fā)至干。將干燥殘?jiān)眠m量水溶解。將其濃度分別調(diào)節(jié)至 2.5、5、10、20、30、40、50 mg·mL?1（按生藥計(jì)算）。將金銀花和灰氈毛忍冬的溶解溶液通過(guò) 0.2 μm 微孔濾膜過(guò)濾，以純化樣品溶液用于抗菌實(shí)驗(yàn)分析。
實(shí)驗(yàn)步驟 量熱系統(tǒng)和平穩(wěn)箱的溫度設(shè)定為 37℃，并采用安瓿法。簡(jiǎn)而言之，將所有裝有金銀花和灰氈毛忍冬以及志賀痢疾桿菌細(xì)胞懸浮液的安瓿瓶密封，并放入 8 通道量熱計(jì)塊中。所有操作均完全滅菌。受試樣品存在下志賀痢疾桿菌生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)熱曲線由 TAM 自動(dòng)繪制，TAM 用于連續(xù)監(jiān)測(cè)該過(guò)程，直到記錄儀返回基線。因?yàn)樵诘葴睾偷热輻l件下監(jiān)測(cè)細(xì)菌代謝過(guò)程，細(xì)胞消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣是有限的。所有數(shù)據(jù)均使用專用軟件包（PicoLog TC-80, TA Corporation, USA）連續(xù)收集。
結(jié)果
1 微生物生長(zhǎng)速率常數(shù)(k)
志賀痢疾桿菌在 37℃ 下的生長(zhǎng)功率-時(shí)間曲線如圖 1 所示。志賀痢疾桿菌的典型生長(zhǎng)曲線可分為四個(gè)階段，即第一指數(shù)期 (A-B)、延滯期 (B-C)、穩(wěn)定期 (C-D) 和衰亡期 (D-E)。代謝的這四個(gè)階段與培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量直接相關(guān)。定量熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)的值如 k、t_G、P_m 和 Q_t 具有不同的含義：k 是 37℃ 下指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率常數(shù)，P_m 是指數(shù)期的最大功率輸出，t_G 是志賀痢疾桿菌的生成時(shí)間，Q_t 是志賀痢疾桿菌生長(zhǎng)的總產(chǎn)熱量。志賀痢疾桿菌的指數(shù)代謝模式可用于兩個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程[13]。
其中 P_0 代表基線開(kāi)始時(shí)的熱輸出功率，P_t 代表時(shí)間 t 時(shí)的熱輸出功率。因此，使用從曲線中取出的 ln P_t 和 t 數(shù)據(jù)擬合線性方程，計(jì)算了在 37℃ 下沒(méi)有金銀花和灰氈毛忍冬時(shí)志賀痢疾桿菌生長(zhǎng)的每個(gè)指數(shù)期的生長(zhǎng)速率常數(shù) k1，如表 1 所示，k = (0.03054 ± 0.00023) min?1。所有相關(guān)系數(shù)均大于 0.98，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 為 0.0075，表明在相同實(shí)驗(yàn)條件下獲得了良好的相關(guān)性和重現(xiàn)性。
圖 1 在 37℃ 下，由微量量熱計(jì)監(jiān)測(cè)的在蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)的志賀痢疾桿菌的 P-t 生長(zhǎng)曲線
表 1 37℃ 下無(wú)藥時(shí)志賀痢疾桿菌的生長(zhǎng)速率常數(shù) (k)
相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；*相關(guān)系數(shù)
實(shí)驗(yàn) k_l/ min?1 RSD
1 0.03029 0.995
2 0.03022 0.9944
3 0.03076 0.9983
4 0.03077 0.9959
5 0.03046 0.9992
6 0.03075 0.9930
平均值 0.03054 0.9961
RSD*(%) 0.75 0.2336
在上述條件下，將不同濃度的金銀花和灰氈毛忍冬樣品溶液依次加入 TAM air 中。如果微生物群體在受限培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，將會(huì)發(fā)生異質(zhì)性。為了獲得其他熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，使用 Origin Lab 軟件（Origin Lab Corporation, Northampton, USA）處理產(chǎn)熱曲線。相應(yīng)的產(chǎn)熱曲線如圖 2 所示。從受不同濃度金銀花和灰氈毛忍冬溶液影響的志賀痢疾桿菌生長(zhǎng)的產(chǎn)熱曲線獲得的定量熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表 2 所示。
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