苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌生長曲線、細(xì)胞凋亡、抑制活性、DNA的影響（一）
摘要 目的：探究苯乳酸（PLA）對(duì)霍氏腸桿菌及其生物被膜中的抑制作用。方法：通過最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）、生長曲線、流式細(xì)胞術(shù)、堿性磷酸酶（AKP）活性、細(xì)胞膜完整性、DNA 含量、運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成量的測(cè)定與激光共聚焦觀察等試驗(yàn)，評(píng)價(jià)PLA 對(duì)霍氏腸桿菌及其生物被膜的抑制作用。結(jié)果：PLA 對(duì)霍氏腸桿菌的MIC 和MBC 分別為1.25 mg/mL 和2.5 mg/mL，在該質(zhì)量濃度下可完全抑制霍氏腸桿菌生長。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明：1/2 MIC 和MIC 苯乳酸不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，而2 MIC PLA 可造成細(xì)胞死亡。28 ℃培養(yǎng)下霍氏腸桿菌的生長曲線雖較37 ℃培養(yǎng)延滯近1 h，但未影響其最大生物量，且細(xì)胞凋亡率沒有顯著差異。PLA 破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，造成細(xì)胞內(nèi)AKP 活性降低，核酸與蛋白質(zhì)泄漏；2 MIC PLA 可導(dǎo)致菌體DNA 含量顯著降低（P＜0.05）；PLA 處理可導(dǎo)致霍氏腸桿菌運(yùn)動(dòng)能力和生物被膜生成量降低。結(jié)論：PLA 對(duì)霍氏腸桿菌及其生物被膜有較強(qiáng)的抑制作用。
霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）是革蘭氏陰性直桿菌，周生鞭毛、兼性厭氧，可以從乳制品、牛奶、水果、蔬菜、大米和嬰兒奶粉等食品中分離出來。霍氏腸桿菌在特定條件下會(huì)引起動(dòng)物和人感染，屬于條件性致病菌。霍氏腸桿菌與陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）同屬于陰溝腸桿菌復(fù)合群，由于抗生素的過度使用和誤用，因此產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性。
生物被膜（Biofilm，BF）是指細(xì)菌附著在有生命或無生命物體表面后被胞外大分子物質(zhì)包裹的細(xì)菌群落。生物被膜具有較強(qiáng)的黏附性，成型后的生物被膜耐受性增強(qiáng)，因其具有很強(qiáng)的三維結(jié)構(gòu)，故能構(gòu)成物理屏障，限制和阻止抗菌劑或其它化學(xué)物質(zhì)的穿透，導(dǎo)致生物被膜中的細(xì)菌難與抗菌劑接觸，產(chǎn)生對(duì)抗菌劑的抗性?；羰夏c桿菌會(huì)在食品與醫(yī)療設(shè)備、運(yùn)輸管道和排水管道上形成生物被膜，且可以長時(shí)間存在，造成更多、更廣泛的污染。因此，有必要發(fā)現(xiàn)新的、天然的霍氏腸桿菌及其生物被膜的抑制劑。
苯乳酸（Phenyllactic acid，PLA）化學(xué)名2-羥基-3-苯基丙酸，是一種天然無毒且具有廣譜抑菌作用的新型生物防腐劑。有報(bào)道證實(shí)PLA 對(duì)大腸桿菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）等有較好的抑菌活性。然而，目前有關(guān)苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌及其生物被膜抑制作用研究較少。
本文以霍氏腸桿菌為研究對(duì)象，測(cè)定苯乳酸對(duì)其最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，通過測(cè)定生長曲線、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、對(duì)DNA 的影響、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜生成量及其微觀結(jié)構(gòu)來分析苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌及其生物被膜的作用機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 菌株與材料
霍氏腸桿菌，渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存；苯乳酸、二乙酸熒光素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LB 營養(yǎng)肉湯、LB 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）、結(jié)晶紫溶液、碘化丙啶（Propidium iodide，PI）、吖啶橙染色液（Acridine orange，AO）、戊二醛，北京索萊寶科技有限公司；抗熒光淬滅封片劑，生工生物工程（上海）股份有限公司；堿性磷酸酶（AKP）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、GeneRed 核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺(tái)，蘇景集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-50L-Ⅰ型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-150 型生化培養(yǎng)箱，昆山一恒儀器有限公司；MS105UD型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利儀器有限公司；THZ-D 型臺(tái)式恒溫振蕩器，蘇州培英實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；Sorvall Legend Micro21R 臺(tái)式微量離心機(jī)，美國Thermo Fisher 公司；全自動(dòng)生長曲線分析儀，芬蘭Bioscreen 公司；Victor X3 型酶標(biāo)儀，美國Perkin Elmer 公司；Accuri C6 Plus 流式細(xì)胞儀，上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；UV2550 型紫外-可見分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；F7000 熒光分光光度計(jì)，日本日立株式會(huì)社；GelDoc XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；TCS-SP5 II 激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌懸液的制備 將貯藏于-80 ℃冰箱中的霍氏腸桿菌取出解凍，接種于LB 肉湯培養(yǎng)基中，分別在28 ℃和37 ℃，160 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)12 h 后，重新接種于新鮮LB 肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至霍氏腸桿菌對(duì)數(shù)生長期，稀釋至濃度為105～106 CFU/mL，備用。
1.3.2 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 采用微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌的MIC。使苯乳酸終質(zhì)量濃度分別為10.000，5.000，2.500，1.250，0.625，0.313，0.156，0.078 mg/mL。分別在28 ℃和37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。以肉眼觀察，無菌生長的最低質(zhì)量濃度即為苯乳酸的MIC。將無菌生長的孔中培養(yǎng)液吸出100 μL 涂布于LB 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，分別繼續(xù)在28 ℃和37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h，無菌落形成的濃度即為苯乳酸的MBC。
1.3.3 霍氏腸桿菌生長曲線的測(cè)定 將苯乳酸溶液加入到霍氏腸桿菌菌懸液中，使其終質(zhì)量濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC，以未添加苯乳酸的菌液為對(duì)照組，使用全自動(dòng)生長曲線儀分別在28 ℃和37 ℃下培養(yǎng)24 h，每間隔1 h 測(cè)定OD600nm 值，并繪制霍氏腸桿菌生長曲線。
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