牛源解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶活力測(cè)定、抗逆性及藥敏試驗(yàn)（三）
2.6體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果
菌株GXUN13068-1體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。菌株GXUN13068-1的發(fā)酵液、菌懸液對(duì)3種致病菌均具有抑菌活性，上清液只對(duì)結(jié)核桿菌具有抑菌活性，其中菌株GXUN13068-1發(fā)酵液對(duì)結(jié)核桿菌的抑制效果最為明顯，圈徑比高達(dá)2.6以上。從體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果可看出菌懸液和發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制效果較上清液明顯，由此可以判斷出GXUN13068-1的抑菌作用主要依賴于菌體本身。
表5菌株GXUN13068-1對(duì)不同病原指示菌的抑菌活性
2.7溶血活性試驗(yàn)結(jié)果
金黃色葡萄球菌和菌株GXUN13068-1在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)如圖7所示，金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)基上出現(xiàn)界限分明，有完全透明的β溶血圈(圖7-a)，而菌株GXUN13068-1在培養(yǎng)基上無(wú)溶血圈(圖7-b)，說(shuō)明菌株GXUN13068-1無(wú)溶血活性。
圖7菌株GXUN13068-1的溶血活性
2.8全基因組測(cè)序分析
2.8.1測(cè)序與組裝結(jié)果分析
通過(guò)對(duì)菌株GXUN13068-1進(jìn)行測(cè)序評(píng)估和組裝，拼接得到菌株GXUN13068-1的基因組環(huán)狀圖譜(圖8)，該菌株全長(zhǎng)4 070 064 bp，有2個(gè)重疊群(contigs)，GC含量為46.46%，共有3 883個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列(CDS)，30個(gè)核糖體RNA(rRNA)、93個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和1個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)-信使RNA(tmRNA)被注釋。
圖8菌株GXUN13068-1的基因組環(huán)狀圖譜CDS:蛋白質(zhì)編碼序列coding sequence;tRNA:轉(zhuǎn)運(yùn)RNA transfer RNA;rRNA:核糖體RNA ribosomal RNA;Other:其他;GC content:GC含量;GC skew+:G含量大于C含量the G content is greater than the C content;GC skew-:G含量小于C含量the G content is less than the C content。
2.8.2基因組功能注釋及預(yù)測(cè)
2.8.2.1 GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果
菌株GXUN13068-1在GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析中共有32 654個(gè)基因被注釋(圖9)，其中屬于生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)的有21 809個(gè)，占比66.79%;屬于細(xì)胞組分(cellular component，CC)的有47 42個(gè)，占比14.52%;屬于分子功能(molecular function，MF)的優(yōu)6 103個(gè)，占比18.69%。在生物學(xué)過(guò)程中，與代謝相關(guān)的基因最多，包括代謝過(guò)程(577個(gè)基因)、細(xì)胞過(guò)程(577個(gè)基因)、有機(jī)物代謝過(guò)程(522個(gè)基因)等;在細(xì)胞組分中，主要與細(xì)胞(611個(gè)基因)、細(xì)胞部件(611個(gè)基因)、細(xì)胞內(nèi)(363個(gè)基因)等有關(guān);在分子功能上，主要與催化活性(501個(gè)基因)、結(jié)合(224個(gè)基因)、轉(zhuǎn)移酶活性(188個(gè)基因)等有關(guān)。同時(shí)，還注釋到抗逆性基因，如制孢調(diào)控(GO:0043937)、產(chǎn)孢(GO:0030435)等。上述結(jié)果表明，菌株GXUN13068-1具有較強(qiáng)的代謝能力及環(huán)境適應(yīng)能力。
圖9菌株GXUN13068-1基因組GO功能分類
2.8.2.2 CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果
將菌株GXUN13068-1基因組與CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果(圖10)顯示有55個(gè)基因被成功注釋，其中最多的是糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GH)基因(25個(gè))，隨后依次為糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases，GT)基因(23個(gè))、碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding modules，CBM)基因(5個(gè))、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，CE)基因(1個(gè))和輔助氧化還原酶基因(auxiliary activities，AA)(1個(gè))。在注釋到的基因中，編碼纖維素酶的基因(GH5家族)有2個(gè)，編碼淀粉酶的基因(GH13家族)有6個(gè)，編碼木聚糖酶的基因(GH43家族)有4個(gè)，編碼糖基水解酶的基因(GH32家族)有3個(gè)。由此可知，菌株GXUN13068-1具有較強(qiáng)的碳水化合物水解能力。
圖10菌株GXUN13068-1基因組CAZy功能分類GT:糖基轉(zhuǎn)移酶glycosyl transferases;GH:糖苷水解酶glycoside hydrolases;CBMs碳水化合物結(jié)合模塊carbohydrate-binding modules;CE:碳水化合物酯酶carbohydrate esterases;AA:輔助氧化還原酶auxiliary activities。
2.8.2.3毒力基因注釋結(jié)果
將菌株GXUN13068-1基因組與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選一致性(identity)≥70%的基因，共找到7個(gè)毒力基因，如表6所示，其中2個(gè)基因與應(yīng)激生存有關(guān)，2個(gè)基因與黏附有關(guān)，2個(gè)基因與免疫調(diào)控有關(guān)，1個(gè)基因與營(yíng)養(yǎng)代謝因子有關(guān)，無(wú)可移動(dòng)毒力基因，無(wú)致病性有關(guān)基因。
表6菌株GXUN13068-1注釋到的毒力基因
2.8.2.4耐藥基因注釋結(jié)果
將菌株GXUN13068-1基因組與CARD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選identity≥80%的基因，共找到2個(gè)耐藥基因——EmrB與GdnD，無(wú)可移動(dòng)耐藥基因。EmrB屬于ATP結(jié)合盒抗生素外排泵(ATP-binding cassette antibiotic efflux pump)基因家族，對(duì)林可胺類抗生素具有抗性。GdnD屬于小多藥耐藥抗生素外排泵(small multidrug resistance antibiotic efflux pump)基因家族，對(duì)氨基糖苷類抗生素、四環(huán)素類抗生素、酚類抗生素具有抗性。
3討論
從動(dòng)物腸道微生物中篩選益生菌株并將其作為飼用益生菌添加到動(dòng)物飼糧中，是一種常用并且高效的益生菌資源開(kāi)發(fā)利用途徑。哺乳動(dòng)物不能自身產(chǎn)生纖維素酶，所需纖維素酶是由胃腸道微生物產(chǎn)生，因此草食動(dòng)物的糞便是篩選產(chǎn)纖維素酶菌的重要來(lái)源，而芽孢桿菌的高抗逆性和高產(chǎn)纖維素酶量使其成為纖維素降解菌研究中的重要菌種。例如，田思齊等從大熊貓糞便中篩選到2株枯草芽孢桿菌，所產(chǎn)纖維素酶活力分別高達(dá)339.48和293.65 U/mL;姜立春等從麥洼牦牛糞便中分離出1株溶桿菌，所產(chǎn)纖維素酶活力為11.88 U/mL。本試驗(yàn)從牛糞便中篩選出的菌株GXUN13068-1為解淀粉芽孢桿菌，所產(chǎn)纖維素酶最高活力可達(dá)126.37 U/mL，產(chǎn)酶效果相對(duì)比較理想。
腸道中有益菌增殖有利于提高動(dòng)物健康和生產(chǎn)力。Wu等研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加復(fù)合益生菌對(duì)提高錦鯉抗氧化能力、血漿生化參數(shù)以及腸道形態(tài)和微生物群有正向影響，提高了錦鯉的生長(zhǎng)性能。Jadamus等研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能顯著提高肉雞的生長(zhǎng)性能，且對(duì)肉雞的腸道菌群產(chǎn)生了有益影響。Markowiak等綜合分析后認(rèn)為，飼糧中添加單一益生菌菌劑或者復(fù)合益生菌菌劑均能促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料中養(yǎng)分的消化和吸收，從而促進(jìn)動(dòng)物體的生長(zhǎng)。Youngblut等的研究表明，在整個(gè)進(jìn)化過(guò)程中，腸道微生物群和動(dòng)物宿主之間有著密切的聯(lián)系。Goel等的研究表明，腸道微生物群和膳食因子之間的相互作用產(chǎn)生了纖維素水解酶，這有助于木質(zhì)纖維素的降解。反芻動(dòng)物的腸道內(nèi)存在多樣性厭氧菌，對(duì)纖維素具有良好的降解能力。腸道菌群通過(guò)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、消化和吸收，提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，減少病原體定植，并維持正常的黏膜免疫，兼具有代謝、營(yíng)養(yǎng)和防御作用。而從動(dòng)物糞便中分離出的菌株來(lái)源于動(dòng)物本身，能較好地適應(yīng)動(dòng)物體內(nèi)胃腸道環(huán)境，容易定植。
芽孢桿菌作為具有廣譜桿菌活性的革蘭氏陽(yáng)性菌，能產(chǎn)生細(xì)菌素抑制病原微生物。于秀菊等從羊駝腸道中分離出1株地衣芽孢桿菌，該菌株對(duì)金黃色葡萄球菌等3種致病菌具有顯著抑制效果，并能改善小鼠腸道形態(tài)，提高了鼠腸道益生菌相對(duì)豐度。朱靜靜等從加州鱸腸道中分離出1株枯草芽孢桿菌，該菌株具有拮抗諾卡氏菌的效果，并促進(jìn)了加州鱸的生長(zhǎng)，減少加州鱸腸道炎癥的發(fā)生。本試驗(yàn)從牛糞便中分離出的1株解淀粉芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌等腸道病原菌具有抑制作用，表明此菌株具有作為微生物飼料添加劑代替抗生素使用的潛能。
耐藥基因和毒力基因注釋結(jié)果顯示，菌株GXUN13068-1僅有2個(gè)耐藥基因，無(wú)可移動(dòng)耐藥基因及毒力基因，無(wú)致病性基因，與其他具有潛在毒力的基因相似度低于80%。因此，可以認(rèn)為菌株GXUN13068-1具有較高的安全性。此外，通過(guò)與GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株GXUN13068-1含有多個(gè)抗逆性基因，為其耐受人工胃液和人工腸液提供了依據(jù)，表明菌株GXUN13068-1具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力及代謝能力;通過(guò)與CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株GXUN13068-1含有多種水解酶，能夠水解纖維素、木聚糖、淀粉等多種碳水化合物，具有較高的碳水化合物水解能力。
4結(jié)論
本試驗(yàn)從牛糞便中分離出1株高產(chǎn)纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌，該菌株對(duì)胃腸道環(huán)境具有良好的耐受能力，沒(méi)有溶血性，對(duì)大部分抗生素敏感，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和結(jié)核桿菌具有明顯的抑菌效果，無(wú)可移動(dòng)耐藥基因及毒力基因，無(wú)致病性基因，具有成為飼用益生菌的潛力。
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