牛源解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶活力測(cè)定、抗逆性及藥敏試驗(yàn)（二）
1.3產(chǎn)酶條件優(yōu)化
對(duì)產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行單因素試驗(yàn):設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6，接種量為1%，發(fā)酵時(shí)間分別為12、24、36、48、60 h，測(cè)定發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響;設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，發(fā)酵時(shí)間為前面得出的最佳發(fā)酵時(shí)間(48 h)，測(cè)定接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響;設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別為5、6、7、8、9，接種量和發(fā)酵時(shí)間為前面得出的最佳接種量(4%)和最佳發(fā)酵時(shí)間(48 h)，測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。
1.4藥敏試驗(yàn)
選擇8種抗菌藥物(氯霉素、新生霉素、阿莫西林、新霉素、慶大霉素、紅霉素、鏈霉素、利福平)，以紙片法對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，以了解待測(cè)菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥性。選取藥敏紙片，按照藥敏紙片擴(kuò)散法操作步驟進(jìn)行相關(guān)菌株的藥敏試驗(yàn)。
1.5抗逆性試驗(yàn)
1.5.1人工胃液耐受性
將待測(cè)菌株接種到NB培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵24 h，將待測(cè)菌株發(fā)酵液按接種量10%接種于10 mL pH分別為2.0、4.0的人工胃液中處理3 h，以0 h的樣品作為對(duì)照，計(jì)算菌株存活率。
1.5.2人工腸液耐受性
將待測(cè)菌株接種到NB培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵24 h，取1 mL待測(cè)菌株發(fā)酵液接種到9 mL膽鹽濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%的人工腸液中處理3 h，以0 h的樣品作對(duì)照，計(jì)算菌株存活率。
1.6體外抑菌試驗(yàn)
采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。以大腸桿菌、結(jié)核桿菌、金黃色葡萄球菌作為指示菌，吸取100μL病原菌菌液，稀釋、涂布后打孔(打孔器直徑9 mm)，再分別吸取待測(cè)菌株的發(fā)酵液、上清液、菌懸液100μL加入孔內(nèi)，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d，重復(fù)3次，測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算圈徑比(抑菌圈直徑/打孔直徑)。
1.7溶血活性試驗(yàn)
以金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照，將待測(cè)菌株及金黃色葡萄球菌劃線接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1 d，觀察有無溶血圈產(chǎn)生。
1.8全基因組測(cè)序分析
采用三代測(cè)序的方法進(jìn)行全基因組測(cè)序分析(委托南寧國(guó)拓生物科技有限公司完成)，使用prokka工具對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行注釋，通過比對(duì)CAZy、GO、VFDB、CARD數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行注釋。
1.9數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，試驗(yàn)結(jié)果使用GraphPad Pism 9.5軟件進(jìn)行單因素方差分析及作圖。
2結(jié)果與分析
2.1目標(biāo)菌株的初篩結(jié)果
根據(jù)單菌落大小、形態(tài)、顏色挑取不同形態(tài)的細(xì)菌進(jìn)行純化，最終選定15株細(xì)菌。采用剛果紅染色法對(duì)選定的菌株進(jìn)行初篩，得到1株能產(chǎn)生透明圈的菌株(圖1)，將其命名為GXUN13068-1，測(cè)量其透明圈直徑為31.23 mm，菌落直徑為16.17 mm，EI為1.93。
圖1菌株GXUN13068-1水解透明圈
2.2菌株鑒定結(jié)果
2.2.1菌株形態(tài)特征
菌株GXUN13068-1菌落表面有褶皺，菌落顏色為灰白色，菌落邊緣呈不規(guī)則狀，表面干燥呈磨砂樣，有火山口狀凸起(圖2-a);經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈藍(lán)紫色，短桿狀(圖2-b);掃描電子顯微鏡下測(cè)量菌體長(zhǎng)約1.52μm，寬約0.65μm(圖2-c)。
圖2菌株GXUN13068-1的菌落形態(tài)(a)、革蘭氏染色(b)及掃描電子顯微鏡鏡檢形態(tài)(c)
2.2.2生理生化特征
菌株GXUN13068-1的生理生化鑒定結(jié)果生理生化鑒定結(jié)果見表1。根據(jù)鑒定結(jié)果，該菌株符合芽孢桿菌的生理生化特征。
表1菌株GXUN13068-1的生理生化鑒定結(jié)果
2.2.3菌株16S rDNA的序列分析
將菌株GXUN13068-1的16S rDNA測(cè)序結(jié)果上傳至EzBioCloud進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，菌株GXUN13068-1與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的序列相似性為99.86%。
2.3菌株GXUN13068-1產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果
當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6，接種量為1%時(shí)，發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株GXUN13068-1產(chǎn)酶能力的影響如圖3所示。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，菌株GXUN13068-1的產(chǎn)酶能力達(dá)到最大，所產(chǎn)纖維素酶活力為103.24 U/mL。
圖3發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株GXUN13068-1產(chǎn)酶能力的影響數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示處理間有顯著差異(P<0.05)。下圖同。
當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6，發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，接種量對(duì)菌株GXUN13068-1產(chǎn)酶能力的影響如圖4所示。當(dāng)接種量為4%時(shí)，菌株GXUN13068-1的產(chǎn)酶能力達(dá)到最大，所產(chǎn)纖維素酶活力為113.23 U/mL。
圖4接種量對(duì)菌株GXUN13068-1產(chǎn)酶能力的影響
當(dāng)接種量為4%，發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株GXUN13068-1產(chǎn)酶能力的影響如圖5所示。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為9時(shí)，菌株GXUN13068-1的產(chǎn)酶能力達(dá)到最大，所產(chǎn)纖維素酶活力為126.37 U/mL。
圖5發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株GXUN13068-1產(chǎn)酶能力的影響
2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果
菌株GXUN13068-1對(duì)8種抗菌藥物的敏感性如圖6和表2所示。根據(jù)美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)的試驗(yàn)要求和標(biāo)準(zhǔn)，菌株GXUN13068-1對(duì)新生霉素、慶大霉素、氯霉素、紅霉素、鏈霉素均表現(xiàn)為敏感，對(duì)新霉素表現(xiàn)為中度敏感，對(duì)利福平和阿莫西林表現(xiàn)出耐藥性。
圖6菌株GXUN13068-1的藥敏試驗(yàn)結(jié)果1:氯霉素chloramphenicol;2:新生霉素neomycin;3:新霉素neomycin;4:慶大霉素gentamicin;5:阿莫西林amoxicillin;6:紅霉素erythromycin;7:鏈霉素streptomycin;8:利福平rifampicin。
表2菌株GXUN13068-1對(duì)8種抗生素的敏感性
S:敏感;I:中介;R:耐藥。
2.5抗逆性試驗(yàn)結(jié)果
2.5.1人工胃液耐受性
菌株GXUN13068-1對(duì)人工胃液的耐受性見表3。菌株GXUN13068-1的存活率隨著人工胃液pH的升高有下降趨勢(shì)，pH 2.0和pH 4.0的人工胃液處理3 h的存活率均在70%以上，說明該菌株對(duì)人工胃液具有良好的耐受性。
表3菌株GXUN13068-1對(duì)人工胃液的耐受性
2.5.2人工腸液耐受性
菌株GXUN13068-1對(duì)人工腸液的耐受性見表4。經(jīng)膽鹽濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%的人工腸液處理3 h后，菌株GXUN13068-1的存活率均在85%以上，說明該菌株對(duì)人工腸液有良好的耐受性。
表4菌株GXUN13068-1對(duì)人工腸液的耐受性
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