攜帶抗生素耐藥基因沙門菌P1噬菌體-質(zhì)粒效價(jià)、形態(tài)、一步生長(zhǎng)曲線及最適溫度（三）
2.5 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒最適溫度和pH穩(wěn)定性
P1噬菌體頭部由蛋白衣殼及雙鏈DNA組成，蛋白質(zhì)在溫度較高或者強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下易產(chǎn)生變性，因此，噬菌體活性往往易受其影響。由于噬菌體衣殼由不同結(jié)構(gòu)蛋白組成，其在不同溫度和酸堿度條件下，活性表現(xiàn)出差異。由圖4可知，P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒在溫度高于50℃時(shí)，噬菌體活力開(kāi)始顯著下降(P<0.05)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，效價(jià)下降明顯。當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，孵育30 min，噬菌體效價(jià)降為初始的十分之一。80℃時(shí)，噬菌體失去活力。當(dāng)溫度在30℃~50℃之間30 min內(nèi)對(duì)噬菌體活性影響較小，其效價(jià)并沒(méi)有顯著變化。而伴隨時(shí)間的延長(zhǎng)，噬菌體活力慢慢降低，因此P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒的最適溫度為30℃~50℃。
圖4 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒不同溫度噬菌體活性
不同酸堿條件下噬菌體的效價(jià)如圖5，噬菌體最佳pH為7，在pH 4~7和7~12噬菌體效價(jià)有所降低，但并不明顯。而當(dāng)pH為2時(shí)，噬菌體效價(jià)顯著降低。所有不同pH情況下，隨著噬菌體孵育時(shí)間長(zhǎng)達(dá)120 min時(shí)，噬菌體活力均有所降低。
圖5 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒不同pH噬菌體活性
2.6 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒適應(yīng)性及穩(wěn)定性測(cè)定
為檢測(cè)P1-CTX噬菌體質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主的影響，試驗(yàn)隨機(jī)挑選P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的大腸埃希菌和沙門菌各2株，檢測(cè)了P1噬菌體-質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)導(dǎo)后的宿主37℃12 h的生長(zhǎng)情況。結(jié)果如圖6所示，P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)前，對(duì)無(wú)論是沙門菌(BYC4和A85)還是大腸埃希菌(RC15和HJM51)宿主的生長(zhǎng)情況影響不明顯。
圖6 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒在不同宿主中的生長(zhǎng)曲線
穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，所選P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的大腸埃希菌和沙門菌各2株30 d傳代培養(yǎng)，P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒在轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主菌中100%穩(wěn)定。
圖7 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒在不同受體宿主菌中穩(wěn)定性
3討論
沙門菌是最為常見(jiàn)的人畜共患病原菌和食源性致病菌之一，世界范圍內(nèi)每年大約有9 380萬(wàn)例沙門菌感染事件，導(dǎo)致15.5萬(wàn)感染者死亡。沙門菌主要通過(guò)被污染的肉類和禽蛋傳遞給人，引發(fā)敗血癥、腹瀉、肺炎、尿路感染等多種疾病。第三代頭孢菌素(third generation cephalosporins，3 GCs)被廣泛應(yīng)用于人醫(yī)和獸醫(yī)領(lǐng)域沙門菌感染疾病的臨床治療中，而耐3 GCs沙門菌的出現(xiàn)對(duì)其引起感染的疾病的防治提出了新的挑戰(zhàn)。blaCTX-M-27亞型基因是介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)3 GCs耐藥的主要基因之一，在全球動(dòng)物和人中均被廣泛檢出，往往造成嚴(yán)重的醫(yī)院和社區(qū)感染，對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生構(gòu)成了重大威脅。有研究者認(rèn)為，質(zhì)粒是介導(dǎo)細(xì)菌間超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)廣泛傳播最常見(jiàn)和最重要的因素，而由噬菌體介導(dǎo)的耐藥基因水平傳播，現(xiàn)在被認(rèn)為要頻繁得多，其在細(xì)菌耐藥發(fā)展中具有重要作用，但往往也最容易被忽視。近年來(lái)，在細(xì)菌中頻繁檢出攜帶耐藥基因的噬菌體，使得噬菌體傳播耐藥性這一問(wèn)題引起人們的重視。因此，研究攜帶耐藥基因的溶源噬菌體的生物學(xué)特性可以全面評(píng)價(jià)噬菌體在耐藥基因傳播中的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
本研究中P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒與其他烈性噬菌體和報(bào)道的大腸埃希菌中P1噬菌體不同，其效價(jià)偏低，其最高可達(dá)106 PFU·mL-1，且絲裂霉素誘導(dǎo)不同條件下均不能完全使噬菌體釋放出來(lái)。溫度為37℃和42℃下能在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)，而溫度在26℃和32℃需要延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間。一步生長(zhǎng)曲線是查看噬菌體的生命周期及爆發(fā)量的最直觀手段，P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒在與受體宿主接觸50 min時(shí)開(kāi)始釋放噬菌體粒子，到100 min時(shí)達(dá)到平臺(tái)期，每一個(gè)噬菌體可釋放出63個(gè)子代噬菌體。而大腸埃希菌中無(wú)抗生素耐藥基因攜帶的P1噬菌體，感染宿主60~70 min開(kāi)始釋放噬菌體子代顆粒，其最高爆發(fā)量可達(dá)100至200 PFU·cell-1。研究表明，噬菌體的生命周期以及噬菌體粒子的產(chǎn)生會(huì)受到某些隨機(jī)事件的影響，如本研究中P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒與P1噬菌體爆發(fā)量的差異，可以推測(cè)P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒的裂解和釋放等特征主要受到噬菌體基因組大小和宿主等因素影響。
感染復(fù)數(shù)影響噬菌體在其宿主菌中的增值，研究表明，高感染復(fù)數(shù)可誘導(dǎo)宿主菌的細(xì)胞裂解，阻斷噬菌體的正常增值。噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)通常作為噬菌體生物學(xué)特性的指標(biāo)之一被廣泛研究，其可以更好的表征噬菌體和宿主菌間作用的最佳濃度比和絕對(duì)數(shù)量。噬菌體相關(guān)研究過(guò)程中，通常需要得到高效價(jià)的噬菌體懸液，所以研究噬菌體與宿主菌間的比例，有利于制備高效價(jià)的噬菌體懸液。本試驗(yàn)P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒的最佳MOI為0.01。本試驗(yàn)同時(shí)也檢測(cè)了P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒在不同環(huán)境條件(溫度和pH)下的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)50℃以下P1-CTX活性影響較小，表明在正常的自然環(huán)境溫度下P1-CTX可穩(wěn)定持續(xù)存活。本研究還測(cè)定了pH對(duì)P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒的影響，發(fā)現(xiàn)P1-CTX在pH為4~12時(shí)，其活力較好，且P1-CTX耐強(qiáng)堿而不耐強(qiáng)酸。綜上可知，相較于其他噬菌體，P1-CTX在環(huán)境中穩(wěn)定性較強(qiáng)，存在較大傳播耐藥基因blaCTX-M-27的風(fēng)險(xiǎn)。
由于噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)后與宿主的相互作用，可改變宿主生長(zhǎng)狀況，包括宿主菌抗生素敏感性、多藥外排泵、適應(yīng)性、生物膜形成、定植入侵以及脂多糖和外膜蛋白等。本研究中的P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒在細(xì)菌中對(duì)宿主細(xì)菌生長(zhǎng)不產(chǎn)生任何代償影響，且30 d的持續(xù)培養(yǎng)噬菌體穩(wěn)定高達(dá)100%。這表明P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒不僅對(duì)宿主沒(méi)有產(chǎn)生任何適應(yīng)性代價(jià)，并且其攜帶的blaCTX-M-27耐藥基因可以促進(jìn)宿主細(xì)菌在抗生素壓力下持續(xù)存在。應(yīng)當(dāng)引起重視是，近期在雞肉沙門菌中也發(fā)現(xiàn)了該P(yáng)1-CTX噬菌體-質(zhì)粒，說(shuō)明P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒具有傳播耐藥的能力。因此，P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒作為一種新的相對(duì)廣泛的宿主譜P1噬菌體，可能在blaCTX-M-27耐藥基因在細(xì)菌間擴(kuò)散起著重要作用。
4結(jié)論
本研究通過(guò)絲裂霉素C成功誘導(dǎo)出攜帶耐藥基因blaCTX-M-27的P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒，其效價(jià)為106 PFU·mL-1，耐強(qiáng)堿而不耐強(qiáng)酸，且其對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的大腸埃希菌和沙門菌宿主生長(zhǎng)無(wú)影響并可持續(xù)穩(wěn)定存在。
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