烏梅等20種中藥的體外抗胸膜肺炎放線桿菌活性研究【?藥敏試驗(yàn)】（二）
藥敏試驗(yàn)方法：采用試管二倍稀釋法.取無(wú)菌試管16支，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組8支.分組編號(hào)后向試驗(yàn)組8支試管中各加l mL TSB肉湯，以無(wú)菌操作吸取已稀釋好的藥物1 mL加入第1管，混勻后依次倍比稀釋至第7管，混勻后自第7管棄去l mL，此時(shí)試管內(nèi)藥液濃度比依次為1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128，相當(dāng)于藥液質(zhì)量濃度為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.60、7.80 mg/mL，第8管不加藥物為對(duì)照組管.對(duì)照組操作同試驗(yàn)組.用微量加樣器取已校正濃度的菌液0.1 mL，依次由低濃度向高濃度加到試驗(yàn)組各管中，混勻后，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后分別觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，以渾濁度為指標(biāo)，以對(duì)照組為參考對(duì)象檢查試管中有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以藥物最低濃度管中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者為該試驗(yàn)菌MIC.將MIC測(cè)定中判定未生長(zhǎng)細(xì)菌的試驗(yàn)組中藥肉湯1 mL涂布于TSA瓊脂平板上，37℃條件培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果，以細(xì)菌菌落個(gè)數(shù)不超5個(gè)的管內(nèi)的藥物濃度，為該藥的MBC.
1.2.4聯(lián)合抑菌活性的研究根據(jù)前期20味中藥有效部位體外MIC的測(cè)定，選取其中抗菌活性較強(qiáng)的幾味中藥進(jìn)行兩兩聯(lián)合抑菌活性的研究.
溶液配制：精確稱取抗菌活性較強(qiáng)的幾種中藥提取物0.20 g，溶于1 mL無(wú)菌蒸餾水中，超聲儀上超聲使其充分溶解，配制成質(zhì)量濃度為200.00 mg/mL的藥物母液，滅菌，4℃冰箱保存.
聯(lián)合用藥選擇藥物的起始濃度約為2 MIC，用TSB培養(yǎng)液對(duì)上述藥液進(jìn)行倍比稀釋，使配方中提取物的初始濃度為2 MIC，終末濃度為1/64 MIC.
藥敏試驗(yàn)：將無(wú)菌96孔板在超凈臺(tái)用紫外燈照射30 min，以棋盤稀釋法8孔稀釋.單用藥物于藥敏板第1孔分別向右向下倍比稀釋，各8孔，每孔100μL，第1排第9孔為空白對(duì)照，第1排第10孔為生長(zhǎng)對(duì)照.聯(lián)合用藥藥敏板則分別在每孔依次加2種藥物各50μL，向右向下2倍稀釋.藥物灌板后，按藥敏板的布局，每孔加入100μL菌懸液.將藥敏板置于微量振蕩器上振蕩，使其充分混勻，37℃條件下培養(yǎng)18～36 h，置于有水環(huán)境中保持液量.
各味中藥藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：參考劉忠義等介紹的判斷標(biāo)準(zhǔn)，MIC＜7.80 mg/mL，為高度敏感;7.80 mg/mL＜MIC＜250.00 mg/mL，為中度敏感;MIC＞250.00 mg/mL，為不敏感.
聯(lián)合用藥效果評(píng)價(jià)：試驗(yàn)結(jié)果以聯(lián)合抑菌指數(shù)(Fractiona inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)來(lái)判斷聯(lián)合效應(yīng)，表示為FICI=MIC(A)聯(lián)合/MIC(A)單獨(dú)+MIC(B)聯(lián)合/MIC(B)單獨(dú)，其中，A，B分別表示2種中藥種類.
當(dāng)FICI≤0.50時(shí)為協(xié)同作用;0.50＜FICI≤1.00時(shí)為相加作用;1.00＜FICI≤2.00時(shí)為無(wú)關(guān)作用;FICI＞2.00時(shí)為拮抗作用.
2結(jié)果
2.1 20種中藥提取物的抗菌活性
由表1可知，20種中藥有效部位提取物中體外抑菌活性最強(qiáng)的為黃連、訶子和烏梅3種中藥，MIC均為15.60 mg/mL，其次為秦皮、地榆和虎杖3種中藥，MIC為31.25 mg/mL，抗菌活性稍差的是白鮮皮、茵陳、大青葉和甘草4種中藥，MIC為62.50 mg/mL，抗菌活性最差的為柴胡和夏枯草，MIC為125.00 mg/mL.由此可見(jiàn)，黃連、烏梅等12味中藥對(duì)胸膜肺炎放線桿菌表現(xiàn)為中度敏感.黃柏、金銀花、板藍(lán)根等8種中藥，MIC均為250.00 mg/mL，無(wú)抑菌活性，為不敏感.另外，黃連MBC為15.60 mg/mL，烏梅和虎杖MBC為31.25 mg/mL，訶子、秦皮、地榆和大青葉MBC為62.50 mg/mL，具有較強(qiáng)的殺菌活性，黃柏、蒲公英等13味中藥MBC≥125.00 mg/mL，表現(xiàn)出較弱殺菌活性.因而筆者選取抗菌活性較強(qiáng)且報(bào)道較少的烏梅、黃連、訶子、秦皮和虎杖5味中藥提取物進(jìn)行后續(xù)的聯(lián)合抑菌活性的研究.
2.2 5種中藥提取物的聯(lián)合抑菌活性
5種中藥提取物兩兩聯(lián)合的抑菌活性結(jié)果見(jiàn)表2，根據(jù)聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)評(píng)價(jià)兩者的聯(lián)合效應(yīng).從表2可以看出，烏梅和秦皮、秦皮和虎杖FICI＞2.00，為拮抗作用;烏梅和黃連、黃連和訶子、黃連和秦皮、訶子和虎杖及黃連和虎杖FICI≤0.50，為協(xié)同作用;烏梅和訶子、烏梅和虎杖、訶子和秦皮0.50＜FICI≤1.00，為相加作用.
表1 20種中藥提取物體對(duì)胸膜肺炎放線桿菌體外抗菌活性
表2 5味中藥提取物兩兩聯(lián)合抑菌活性結(jié)果
3討論
試驗(yàn)采用二倍稀釋法進(jìn)行胸膜肺炎放線桿菌的體外抑菌試驗(yàn).由于中藥成分復(fù)雜，不同提取方法對(duì)抑菌活性有很大影響，本試驗(yàn)主要根據(jù)文獻(xiàn)中最佳提取工藝對(duì)中藥有效部位進(jìn)行提取，然后測(cè)定中藥的MIC值.
據(jù)LIU等報(bào)道，氟苯尼考、頭孢噻呋等化學(xué)藥物對(duì)胸膜肺炎放線桿菌療效顯著，普遍用于胸膜肺炎放線桿菌的治療，而Yoshimura等檢測(cè)了16種抗菌化學(xué)藥物對(duì)不同血清型胸膜肺炎放線桿菌體外抑菌活性，發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類和頭孢噻呋對(duì)胸膜肺炎放線桿菌抗菌活性較好，青霉素、黏菌素等抗生素對(duì)胸膜肺炎放線桿菌效果較弱，而且不同血清型胸膜肺炎放線桿菌都對(duì)它們產(chǎn)生了不同程度耐藥性.
本研究檢測(cè)到的黃連、訶子和烏梅MIC均為15.60 mg/mL，秦皮、地榆和虎杖MIC均為31.25 mg/mL，同時(shí)，黃連、烏梅、虎杖、訶子、秦皮和地榆MBC≤62.50 mg/mL，說(shuō)明了黃連、訶子和烏梅等6種中藥中有效部位有較強(qiáng)的抑殺菌作用.據(jù)葛冰等報(bào)道，將黃芪、桑白皮、陳皮和連翹4種中藥進(jìn)行組方后試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些組合無(wú)毒副作用，無(wú)污染，無(wú)藥物殘留，超微粉碎后生物利用度高，療效顯著，臨床對(duì)豬胸膜肺炎放線桿菌有特效.劉仁志等利用大蒜揮發(fā)油及其復(fù)方對(duì)胸膜肺炎放線桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，證明大蒜揮發(fā)油及其復(fù)方MIC為3.90 mg/mL，MBC為7.80 mg/mL有較強(qiáng)的抗菌活性.而宋波等、蔡小華等報(bào)道，黃連、烏梅、訶子、虎杖等對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎球菌等體外抑菌結(jié)果表明其MIC在7.80～250.00 mg/mL之間，為中度敏感，說(shuō)明6種中藥活性部位能增強(qiáng)對(duì)細(xì)菌的抑菌作用.本試驗(yàn)研究表明黃連、烏梅和訶子等6種中藥對(duì)胸膜肺炎放線桿菌有較強(qiáng)抗菌作用，為后續(xù)藥物研究開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ).
聯(lián)合抑菌試驗(yàn)顯示，黃連與烏梅、秦皮、訶子、虎杖聯(lián)合都產(chǎn)生協(xié)同作用，具有良好的抗菌作用.但由于黃連主要成分為鹽酸小檗堿，在配伍時(shí)能與大多數(shù)中藥形成沉淀，影響抗菌活性，同時(shí)由于訶子含有大量鞣質(zhì)，在進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)時(shí)也會(huì)出現(xiàn)沉淀，影響試驗(yàn)結(jié)果觀察.因此，在進(jìn)行含有黃連和訶子的相關(guān)試驗(yàn)中應(yīng)優(yōu)化提取工藝，以減少沉淀的產(chǎn)生.而在聯(lián)合抑菌試驗(yàn)中，秦皮與烏梅、虎杖都呈拮抗作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證.
本研究表明，黃連、烏梅、訶子、虎杖、秦皮等中藥對(duì)胸膜肺炎放線桿菌具有較好的抗菌活性，黃連和烏梅、虎杖以及訶子呈協(xié)同或相加作用，研究結(jié)果為篩選治療胸膜肺炎放線桿菌病中藥新藥具有重要意義.
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