量化人類腸道菌種對(duì)艱難梭菌長(zhǎng)期生長(zhǎng)的影響（四）
關(guān)鍵的突變?cè)谄D難梭菌中顯著改變了代謝活動(dòng)
因?yàn)檫M(jìn)化型艱難梭菌的突變可能影響代謝活動(dòng)，我們對(duì)高碳水化合物環(huán)境下進(jìn)化型和原始型艱難梭菌菌株的exo-代謝組學(xué)特征進(jìn)行了表征(見圖3B和S7F)，以及限碳水化合物環(huán)境下的exo-代謝組學(xué)特征(見圖S5)。盡管原始菌株在代謝方面已知能夠利用脯氨酸，但進(jìn)化型菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中并未顯著消耗脯氨酸(見圖3B)。相反，進(jìn)化型菌株比原始菌株更有效地利用甘氨酸、天冬氨酸和N-乙酰甘氨酸。與此相反，進(jìn)化型艱難梭菌在限碳水化合物培養(yǎng)基中的單菌種和與PV共培養(yǎng)條件下，脯氨酸的利用率顯著降低，其他氨基酸如甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和絲氨酸的消耗率顯著提高(見圖S5D)。此外，在兩種培養(yǎng)基條件下，進(jìn)化型菌株的葡萄糖消耗量也高于原始菌株(見圖3B和S5D)。
為了探討這些突變?nèi)绾斡绊懫D難梭菌基因表達(dá)譜，我們?cè)诨A(chǔ)培養(yǎng)基中無PV和有PV條件下，對(duì)原始型和進(jìn)化型艱難梭菌菌株進(jìn)行了基因組范圍轉(zhuǎn)錄組分析(見圖3C、S9A和S9B)。在3,508個(gè)總基因中，89個(gè)和55個(gè)在進(jìn)化型艱難梭菌中顯著高表達(dá)和低表達(dá)，分別高于原始菌株(見圖3D和3E；表S8)。PTS相關(guān)基因，包括突變的基因206，在進(jìn)化型菌株中顯著高表達(dá)。這表明，進(jìn)化型菌株在轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化碳水化合物方面適應(yīng)性更強(qiáng)，促進(jìn)了如葡萄糖等碳水化合物的高效利用(見圖3B)。盡管prdR表達(dá)變化不大(1.4倍上調(diào))，但prd和grd操縱子的表達(dá)發(fā)生了顯著變化。特別是甘氨酸還原酶編碼基因顯著上調(diào)(2.1-至305倍)，而脯氨酸還原酶編碼基因則顯著下調(diào)(3.0-至9.7倍)，與原始菌株相比(見圖3E)。這一結(jié)果與exo-代謝組學(xué)結(jié)果一致，顯示了進(jìn)化型菌株在脯氨酸和甘氨酸利用方面的變化(見圖3B)。
一些代謝基因，如負(fù)責(zé)Wood-Ljungdahl路徑(WLP)碳羰基分支的一氧化碳脫氫酶/乙酰-CoA合酶復(fù)合體，能夠?qū)O?轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA，在進(jìn)化型菌株中比原始菌株高表達(dá)(見圖3E)。WLP是最重要的能量產(chǎn)生和碳固定代謝之一，其中兩個(gè)CO?分子作為終端電子受體被還原為乙酰-CoA，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為乙酸。除此之外，包括thlA1、hbd、crt2(將乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為丁酰-CoA)以及ptb和buk(將丁酰-CoA轉(zhuǎn)化為丁酸)的生產(chǎn)丁酸基因在進(jìn)化型菌株中顯著高表達(dá)。與這些基因表達(dá)模式一致，進(jìn)化型菌株丁酸生產(chǎn)能力比原始菌株高出2.7倍(見圖S9G)。作為一個(gè)參考，這種增強(qiáng)的丁酸生產(chǎn)能力(11.6 mM)與在類似培養(yǎng)基中培養(yǎng)的主要丁酸生產(chǎn)菌科普羅科科斯(Coprococcus comes)相當(dāng)，可能在體內(nèi)影響疾病嚴(yán)重程度。此外，先前的研究表明某些擬桿菌屬顯示出對(duì)丁酸的營(yíng)養(yǎng)特異性生長(zhǎng)敏感。在3種擬桿菌屬中(PV、BT、BU)，只有PV在響應(yīng)中等濃度的丁酸時(shí)顯示出顯著的生長(zhǎng)抑制。進(jìn)化型菌株產(chǎn)生的丁酸濃度位于PV丁酸-劑量響應(yīng)曲線的低抑制區(qū)域(見圖S9H)。
在與PV共培養(yǎng)時(shí)，無論是原始菌株還是進(jìn)化型艱難梭菌菌株均上調(diào)了丁酸發(fā)酵基因，而進(jìn)化型菌株的這些基因表達(dá)更高(見圖S9C–S9E；表S9–S11)。由于培養(yǎng)基中不含丁酸，這表明了PV的交叉喂養(yǎng)現(xiàn)象，與有機(jī)酸測(cè)量結(jié)果的模式一致(見圖2C和2D)。值得注意的是，在進(jìn)化型艱難梭菌菌株存在下，PV顯示出了許多與氨基酸生物合成相關(guān)的基因高表達(dá)，而與原始菌株相比(見圖S7B和S9F)。進(jìn)化型艱難梭菌菌株消耗了比原始菌株更多的氨基酸(甘氨酸、纈氨酸、絲氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)(見圖S5D)。這表明，PV向進(jìn)化型艱難梭菌菌株的氨基酸交叉喂養(yǎng)可能比與原始菌株相比得到了增強(qiáng)(見圖S7B和S7C)。
進(jìn)化型艱難梭菌菌株的生長(zhǎng)受甘氨酸限制較小，對(duì)高葡萄糖濃度表現(xiàn)出增強(qiáng)反應(yīng)
一個(gè)關(guān)鍵未解的問題是，這些代謝適應(yīng)如何影響艱難梭菌在不同環(huán)境中的適應(yīng)性(fitness)。為了評(píng)估適應(yīng)性變化，我們研究了進(jìn)化型和祖先型艱難梭菌菌株在不同氨基酸濃度下的生長(zhǎng)情況。在氨基酸濃度降低(20%)的早期時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)化型艱難梭菌菌株的生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)，而在其他條件下，兩者的生長(zhǎng)反應(yīng)類似(圖S7D)。
進(jìn)化型艱難梭菌菌株的脯氨酸EC50(脯氨酸濃度，能夠達(dá)到最大生長(zhǎng)的50%)顯著低于祖先型菌株(圖S10A和S10E)。這一結(jié)果表明，進(jìn)化型菌株在低脯氨酸濃度下的競(jìng)爭(zhēng)效率顯著高于祖先型菌株。脯氨酸在我們實(shí)驗(yàn)條件下是祖先型艱難梭菌菌株的生長(zhǎng)限制資源，這與其他具有多樣基因組的艱難梭菌菌株一致。然而，進(jìn)化型菌株對(duì)脯氨酸的需求顯著低于祖先菌株，正如我們代謝組學(xué)數(shù)據(jù)(圖3B)所示。與這一結(jié)果一致，在PV共培養(yǎng)中，進(jìn)化型菌株的豐度不隨脯氨酸濃度變化，這表明其生長(zhǎng)處于脯氨酸濃度的飽和狀態(tài)(圖S10G)。相比之下，祖先型菌株的豐度隨著脯氨酸濃度的增加而增加(即脯氨酸劑量反應(yīng)的線性狀態(tài))。在低初始脯氨酸濃度下，進(jìn)化型艱難梭菌菌株在12小時(shí)共培養(yǎng)中的豐度高于祖先型菌株，最終在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)下降(圖3F)。由于進(jìn)化型菌株比祖先菌株更能消耗甘氨酸(圖3B)，我們還研究了其對(duì)不同濃度甘氨酸的生長(zhǎng)反應(yīng)。在單培養(yǎng)(圖S10B和S10D)以及共培養(yǎng)PV(圖S10H)條件下，進(jìn)化型和祖先菌株的生長(zhǎng)響應(yīng)顯示出類似的趨勢(shì)。
雖然進(jìn)化型艱難梭菌菌株的葡萄糖EC50值高于祖先菌株，但進(jìn)化型菌株在高葡萄糖濃度下表現(xiàn)出更高的生物量(即更高的最大生長(zhǎng)產(chǎn)量，圖S10C和S10F)。這種生物量的增加并未通過單細(xì)胞水平上細(xì)胞大小和形態(tài)的變化來解釋(圖S7E)。這些發(fā)現(xiàn)暗示了在葡萄糖的生長(zhǎng)產(chǎn)量和敏感性之間存在權(quán)衡。總之，進(jìn)化型艱難梭菌菌株的代謝活動(dòng)改變影響了其在不同脯氨酸和葡萄糖組合環(huán)境中的適應(yīng)性(圖3G、3H和S11)。在高葡萄糖和低脯氨酸濃度條件下，相比祖先菌株，進(jìn)化型菌株的適應(yīng)性得到了增強(qiáng)。在某些環(huán)境中，這種適應(yīng)性改變可能使進(jìn)化型菌株在定殖過程中優(yōu)于其他菌株，從而可能影響疾病結(jié)果。
進(jìn)化型艱難梭菌菌株顯示出與人類腸道菌群的種間交互作用的變化
艱難梭菌代謝的顯著變化將影響人體腸道微生物群種間的交互作用。為了探討這些關(guān)鍵突變?nèi)绾斡绊懮鷳B(tài)網(wǎng)絡(luò)，我們構(gòu)建了包含進(jìn)化型或原始艱難梭菌菌株的2-8成員群落的96種組合。其他種類(CS、CH、DP、BT、PV、BU和CA)在長(zhǎng)期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中使用，廣泛分布于不同個(gè)體之間，涵蓋了人類腸道微生物群的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，并在不同環(huán)境中被廣泛研究(圖4A)。我們將gLV模型擬合到物種絕對(duì)豐度的時(shí)間序列數(shù)據(jù)(表S3 DATASET002；圖S12A、S13A和S13B)。為了評(píng)估模型對(duì)未使用數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)性能，我們進(jìn)行了20倍交叉驗(yàn)證(圖S12B；STAR Methods)。模型預(yù)測(cè)與測(cè)得的物種豐度之間的吻合度良好(Pearson’s R=0.95–0.99,p<10E?05)。
圖4|關(guān)鍵代謝基因突變改變了艱難梭菌與人體腸道微生物群種間的交互作用
(A)工作流程示意圖，用于解析艱難梭菌祖先株和進(jìn)化株與人體腸道微生物之間的交互作用(STAR方法；表S3 DATASET002)。
(B和C)7種腸道微生物與祖先(B)和進(jìn)化(C)艱難梭菌株之間的推斷種間交互網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)大小代表各物種的載體容量，邊的寬度表示種間交互系數(shù)(aij)的大小。熱圖顯示了社區(qū)中8種物種之間的aij。
(D)祖先株與進(jìn)化株艱難梭菌株的社區(qū)之間aij的散點(diǎn)圖?；疑?藍(lán)色)數(shù)據(jù)點(diǎn)是兩種腸道微生物之間(艱難梭菌與腸道微生物)的aij。藍(lán)色虛線表示兩社區(qū)aij值之間的線性回歸。兩側(cè)皮爾遜相關(guān)系數(shù)r和p值顯示。
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