改善不可培養(yǎng)微生物可培養(yǎng)效率的方法有哪幾種
2、改善不可培養(yǎng)微生物可培養(yǎng)效率的方法
2.1分散群體微生物
一種方法是在固體培養(yǎng)基上重復(fù)劃線，目的是將微生物從群落中分離出來(lái);另一種是在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行一系列重復(fù)的稀釋來(lái)分離細(xì)胞。通過(guò)這些方法已經(jīng)純培養(yǎng)出許多種類(lèi)微生物，而這些種類(lèi)所屬的門(mén)類(lèi)沒(méi)有或者只有很少代表物種。然而用這些分離方法培養(yǎng)出的種類(lèi)一般是生長(zhǎng)迅速的微生物。
2.2常規(guī)培養(yǎng)方法的改進(jìn)
2.2.1培養(yǎng)基的改善①添加非傳統(tǒng)的碳源、電子供體與受體:2001年Uphoff等將北海的海水樣品在添加了多種不同碳源和復(fù)雜化合物的培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)，它比僅含有一種碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物種類(lèi)和數(shù)量都多。單一碳源分離的菌種幾乎完全屬于變形菌，而在復(fù)合的培養(yǎng)基上則分離到4種其他門(mén)類(lèi)的代表物種。2005年Kopke等在培養(yǎng)基中加入多樣的電子受體和碳源從地下煤沉淀物中分離出新種類(lèi)的微生物。最近，由特殊的原核生物生態(tài)群落催化的新還原產(chǎn)物也被用于豐富傳統(tǒng)培養(yǎng)基的類(lèi)型，并且發(fā)現(xiàn)了新的種類(lèi);②采用低濃度營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基或者加入具有毒性氧降解能力的物質(zhì):高濃度營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)方法由于產(chǎn)生毒性氧物質(zhì)導(dǎo)致所培養(yǎng)的微生物數(shù)量和種類(lèi)都減少，Aagot發(fā)現(xiàn)在低濃度營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的微生物較多，但是營(yíng)養(yǎng)成分濃度過(guò)低也使微生物數(shù)量下降。減少毒性氧物質(zhì)的產(chǎn)生也是提高微生物可培養(yǎng)性的一個(gè)有利方法。增加多聚物作為碳源，因?yàn)槎嗑畚镏挥斜环纸獬尚》肿游镔|(zhì)才能被利用，這樣微生物在短時(shí)間內(nèi)不會(huì)受到毒害作用，有效地減緩了受毒害的速度。減少培養(yǎng)環(huán)境中的氧分壓也可以減弱由充足的氧氣而導(dǎo)致毒性氧的傷害。同時(shí)，在培養(yǎng)過(guò)程中添加過(guò)氧化氫酶、丙酮酸鈉、α-酮戊二酸、二硫代二丙酸等具有毒性氧降解能力的物質(zhì)也可以大大提高微生物可培養(yǎng)性;③增加信號(hào)分子來(lái)維持微生物之間的相互作用:氮酰高絲氨酸內(nèi)酯可以有效地提高微生物可培養(yǎng)性，基于這個(gè)發(fā)現(xiàn)，用于多種基因調(diào)控的信號(hào)分子cAMP相對(duì)于氮酰高絲氨酸內(nèi)酯更能夠促使微生物的生長(zhǎng)，提高了微生物的可培養(yǎng)性。有些細(xì)菌例如藤黃微球菌可以分泌一種促進(jìn)復(fù)活因子能夠有效地恢復(fù)處于休眠期的革蘭陽(yáng)性菌的活性;④添加酶、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素或者其他抑制劑:添加酶來(lái)培養(yǎng)一些產(chǎn)生活性氧的物種，添加某種抑制劑來(lái)抑制不希望生長(zhǎng)的微生物，例如引入抗生素作為一種新型的能源抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng);⑤其他類(lèi)型凝固劑代替常用的瓊脂:常規(guī)的培養(yǎng)基中用瓊脂作為凝固劑，但是它對(duì)某些微生物具有一定程度的毒害作用，降低了可培養(yǎng)的微生物數(shù)量及種類(lèi)。采用古蘭糖膠，對(duì)微生物沒(méi)有毒害作用，而且凝固效果比瓊脂更好。
2.2.2培養(yǎng)條件的改變延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間、降低接種量濃度都可以培養(yǎng)出不可培養(yǎng)微生物。有些微生物屬于寡營(yíng)養(yǎng)菌，比如在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至3個(gè)月，就可長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的菌落，但是培養(yǎng)時(shí)間不能無(wú)限延長(zhǎng)，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)微生物培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌要求就越高。降低接種量濃度也能夠使活菌數(shù)增加，這種菌并不因?yàn)榻臃N量的降低影響它們?nèi)郝涞男纬伞?
2.3模擬自然生存環(huán)境
目前，2種新穎的自制培養(yǎng)儀器已經(jīng)發(fā)展成熟，分別是擴(kuò)散盒培養(yǎng)和含有有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)的原位群體載體培養(yǎng)。擴(kuò)散盒由一個(gè)濾膜組成，它只允許培養(yǎng)環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)和低分子量產(chǎn)物的通過(guò)而限制細(xì)胞通過(guò)，化學(xué)物質(zhì)穿過(guò)薄膜與周?chē)h(huán)境因子交換，可保證微生物群落間作用的存在，提高微生物可培養(yǎng)性。土壤、海洋、活性淤泥都可以在擴(kuò)散盒中培養(yǎng)出不可培養(yǎng)微生物。原位群體載體培養(yǎng)能夠有效地克服原核生物黏附在固體表面導(dǎo)致的生長(zhǎng)限制，很多文獻(xiàn)內(nèi)已經(jīng)描述了不同載體的自然生態(tài)系統(tǒng)，例如陶瓷、鈦裝置、多孔無(wú)機(jī)基板、聚氨酯泡沫塑料等載體。包有選擇性底物的原位集合物也可以有效地培養(yǎng)出目的微生物。此外，有些特殊裝置僅模擬一個(gè)或者幾個(gè)重要的物化因素來(lái)培養(yǎng)新的微生物。2009年Zeng等模擬高壓環(huán)境從最深的高溫噴火口分離出嗜高壓和高溫的古生菌。還有一種是流動(dòng)裝置，可以在自然環(huán)境原位溫度、壓力和液體流動(dòng)的條件下連續(xù)培養(yǎng)，成功模擬深海環(huán)境中液體化學(xué)成分的變化。2007年Houghton等利用這種裝置培養(yǎng)出新的微生物。
2.4微生物群體培養(yǎng)
自然環(huán)境中微生物之間有些是通過(guò)交換代謝產(chǎn)物或者特異信號(hào)分子進(jìn)行直接的細(xì)胞交流，有些是競(jìng)爭(zhēng)有限的生存環(huán)境，有些是共同利用微量元素(如維生素)和螯合劑，因此單一的微生物培養(yǎng)不能完成復(fù)雜的細(xì)胞間相互交流。2個(gè)典型的群體培養(yǎng)的例子是多細(xì)胞培養(yǎng)裝置和生物膜，都可以實(shí)施單個(gè)物種培養(yǎng)不可能實(shí)現(xiàn)的多功能培養(yǎng)。復(fù)雜有機(jī)物的纖維素降解或甲烷轉(zhuǎn)換就是利用多細(xì)胞裝置實(shí)現(xiàn)的。此外，小部分共生的微生物可以在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基上添加一些微量元素、共底物等可以培養(yǎng)出來(lái)。群體培養(yǎng)能夠有效地培養(yǎng)出共生和互生微生物。利用透析膜反應(yīng)器的群體培養(yǎng)方法已經(jīng)成功的從厭氧淤泥中培養(yǎng)出厭氧嗜熱的降解谷氨酸的微生物。
2.5高通量培養(yǎng)
為了從自然環(huán)境中篩選出新的生物化學(xué)分子和酶類(lèi)，發(fā)展了不依賴培養(yǎng)基的高通量培養(yǎng)方法。1993年Button提出稀釋培養(yǎng)法，即將微生物群體稀釋至痕量時(shí)(1～5個(gè)細(xì)胞/mL)，寡營(yíng)養(yǎng)微生物可以不受其他優(yōu)勢(shì)微生物的干擾，因而可以被培養(yǎng)出來(lái)。隨后，Connon采用稀釋培養(yǎng)法將微生物樣品稀釋至痕量后，采用微量細(xì)胞培養(yǎng)板和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)分離培養(yǎng)并檢測(cè)出許多微生物，這種方法不僅能有效提高微生物的可培養(yǎng)性，還可在短期內(nèi)檢測(cè)出目標(biāo)培養(yǎng)物，并進(jìn)行大量的培養(yǎng)，提高工作效率。2005年Zengler等提出細(xì)胞包囊法，將微生物樣品先進(jìn)行稀釋?zhuān)缓笕榛?，部分微生物形成了僅含單個(gè)細(xì)胞的膠狀微滴，隨后將其裝入層析柱內(nèi)，讓培養(yǎng)液連續(xù)通過(guò)層析柱進(jìn)行流態(tài)培養(yǎng)。這種方法已從不同樣品中分離出多種細(xì)菌和真菌。2007年Ingham等提出多孔微生物培養(yǎng)芯片，它是由一種獨(dú)特的多孔陶瓷做成，被分割成數(shù)千個(gè)小室，在小室中進(jìn)行獨(dú)立的微生物培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)分子可以通過(guò)多孔膜四處擴(kuò)散維持微生物的生長(zhǎng)。
到目前為止，不可培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)方法仍然存在一定的局限性。這主要是由于缺乏對(duì)微生物的多樣性、生存環(huán)境以及在生物進(jìn)化中地位的認(rèn)識(shí)，也由于實(shí)驗(yàn)室中無(wú)法設(shè)計(jì)微生物生長(zhǎng)的原位環(huán)境實(shí)現(xiàn)群體培養(yǎng)。因此，必須全面理解微生物生理適應(yīng)性與群體行為，發(fā)展和革新培養(yǎng)技術(shù)，改變微生物培養(yǎng)方式，設(shè)計(jì)盡可能接近微生物生活的自然環(huán)境，培養(yǎng)出更多的“不可培養(yǎng)微生物”，從中發(fā)現(xiàn)新的酶類(lèi)和化合物，使其應(yīng)用于制藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、化工業(yè)等領(lǐng)域。
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