基于全細(xì)胞生長(zhǎng)的 GAT 生長(zhǎng)耦合策略，突破合成肌酸過(guò)程中的代謝瓶頸
肌酸是一種通過(guò)肌酸/磷酸肌酸系統(tǒng)在脊椎動(dòng)物中作為能量?jī)?chǔ)存和緩沖系統(tǒng)的分子，其中磷酸基團(tuán)通過(guò)酶促反應(yīng)在ATP和肌酸之間轉(zhuǎn)移。該分子在肌肉發(fā)育和神經(jīng)生理性能中發(fā)揮重要作用。人類(lèi)內(nèi)源性肌酸合成量（約1克/天）僅能滿(mǎn)足每日需求的一半（約2克/天），因此需要補(bǔ)充。然而，肌酸僅存在于動(dòng)物性食物中，這突顯了植物性飲食中替代肌酸補(bǔ)充的重要性。目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的肌酸是通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)，嚴(yán)重依賴(lài)于化石燃料基的原材料，成本較高。此外，由于殘留的氰胺衍生物可能導(dǎo)致食品污染，其去除過(guò)程會(huì)顯著增加下游工藝的成本。
近日，期刊《Metabolic Engineering》上發(fā)表了研究論文“Microbial production of creatine using growth-coupled selection systems”，使用表達(dá)異源途徑的大腸桿菌細(xì)胞工廠(chǎng)開(kāi)發(fā)生物合成過(guò)程，作為一種化學(xué)合成的替代方案。并采用了一種基于模型的生長(zhǎng)耦合選擇方法，結(jié)合適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化，以克服異源合成肌酸過(guò)程中的代謝瓶頸。
經(jīng)過(guò)多次設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)的進(jìn)化與選擇循環(huán)，與對(duì)照菌株相比，從甘氨酸和精氨酸合成的肌酸產(chǎn)量提高了58%。脊椎動(dòng)物中肌酸由精氨酸和甘氨酸經(jīng)兩步酶促反應(yīng)合成，即甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶（GAT）將兩者轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)氨酸和胍基乙酸（GAA），胍基乙酸甲基轉(zhuǎn)移酶（GAMT）利用輔因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將GAA甲基化生成肌酸。研究團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中組裝了該途徑，篩選并密碼子優(yōu)化了8種GAT和4種GAMT酶，發(fā)現(xiàn)GAT8與GAMT4組合的生產(chǎn)效果最佳。
在該研究中，甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶（GAT）是肌酸生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)兩種生長(zhǎng)耦合策略對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，核心內(nèi)容如下：設(shè)計(jì)1：基于全細(xì)胞生長(zhǎng)的GAT生長(zhǎng)耦合策略設(shè)計(jì)思路該策略旨在通過(guò)代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)，將GAT的催化活性與大腸桿菌的生長(zhǎng)直接關(guān)聯(lián)——即GAT活性越高，細(xì)胞生長(zhǎng)越好，從而實(shí)現(xiàn)高效篩選。具體設(shè)計(jì)基于基因組尺度代謝模型：
·讓精氨酸和甘氨酸作為唯一碳源，GAT催化二者生成鳥(niǎo)氨酸；
·通過(guò)異源表達(dá)鳥(niǎo)氨酸環(huán)脫氨酶（OCD），將鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸，而脯氨酸作為碳源和能量來(lái)源參與生物量合成；
·敲除可能繞過(guò)GAT反應(yīng)的替代途徑，確保GAT活性是鳥(niǎo)氨酸生成的唯一途徑，進(jìn)而成為生長(zhǎng)必需條件。
實(shí)驗(yàn)挑戰(zhàn)與失敗原因
·OCD活性不足：初始使用的OCD突變體（OCDv1）催化效率低，無(wú)法將鳥(niǎo)氨酸有效轉(zhuǎn)化為脯氨酸，導(dǎo)致細(xì)胞在鳥(niǎo)氨酸作為碳源時(shí)無(wú)法生長(zhǎng)；通過(guò)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化仍未解決核心問(wèn)題。
·精氨酸對(duì)OCD的抑制：精氨酸與鳥(niǎo)氨酸分子結(jié)構(gòu)相似，會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合OCD的活性位點(diǎn)，抑制其催化功能。當(dāng)精氨酸濃度較高時(shí)，OCD幾乎失活，導(dǎo)致GAT與生長(zhǎng)的耦合關(guān)系斷裂，最終該設(shè)計(jì)失敗。
設(shè)計(jì)2：基于脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷的GAT生長(zhǎng)耦合策略（優(yōu)化后）設(shè)計(jì)思路由于設(shè)計(jì)1中“全生物量生長(zhǎng)耦合”對(duì)GAT活性要求過(guò)高，且受精氨酸抑制影響顯著，團(tuán)隊(duì)改為“弱耦合”策略——僅將GAT活性與細(xì)胞對(duì)脯氨酸的基礎(chǔ)需求關(guān)聯(lián)，降低代謝負(fù)擔(dān)：
·敲除脯氨酸合成基因（ΔproB），使細(xì)胞成為脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，必須依賴(lài)外源脯氨酸或通過(guò)鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化獲??；
·同時(shí)敲除鳥(niǎo)氨酸內(nèi)源合成基因（ΔargA），確保鳥(niǎo)氨酸只能通過(guò)GAT催化精氨酸和甘氨酸生成，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為脯氨酸滿(mǎn)足生長(zhǎng)需求；
·該設(shè)計(jì)大幅降低了對(duì)GAT的通量要求，且通過(guò)調(diào)控精氨酸濃度可避免OCD抑制，使GAT活性與生長(zhǎng)的耦合關(guān)系穩(wěn)定。篩選結(jié)果通過(guò)該策略對(duì)GAT隨機(jī)突變庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得3種高效GAT變體（GAT8_v1、v2、v3）：
·這些變體的突變位點(diǎn)集中在預(yù)測(cè)的α螺旋和底物結(jié)合口袋，可能通過(guò)改變蛋白結(jié)構(gòu)增強(qiáng)催化效率；與野生型GAT8相比，其胍基乙酸（GAA，肌酸直接前體）產(chǎn)量提升73%-94%，最終使肌酸產(chǎn)量較基準(zhǔn)菌株提高58%，達(dá)到100 mg/L以上。
隨后，作者發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)肌酸積累會(huì)抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，通過(guò)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（ALE），在逐步提高胍基乙酸（GAA）濃度的條件下進(jìn)化菌株，獲得的耐受菌株與優(yōu)化的GAT變體結(jié)合后，肌酸產(chǎn)量較基準(zhǔn)菌株提升58%，達(dá)到100 mg/L以上。該研究成功在大腸桿菌中重構(gòu)了肌酸生物合成途徑，通過(guò)生長(zhǎng)耦合選擇系統(tǒng)與適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化結(jié)合，克服了代謝瓶頸和產(chǎn)物毒性問(wèn)題，為替代化學(xué)合成、實(shí)現(xiàn)肌酸可持續(xù)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，也為生物制造中生長(zhǎng)耦合生產(chǎn)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)提供了參考。
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