芽胞桿菌合成次級(jí)代謝產(chǎn)物Surfactin肽段分類(lèi)地位及促生功能
Surfactin是芽胞桿菌合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，由7個(gè)α-氨基酸殘基的環(huán)短肽與鏈長(zhǎng)為12-17個(gè)碳原子的β-羥基脂肪酸通過(guò)內(nèi)酯鍵交聯(lián)組成的環(huán)狀物質(zhì)。Surfactin家族典型的頭部氨基酸順序?yàn)椋篖-Glu1-L-Leu2-D-Leu3-L-Val4-L-Asp5-D-Leu6-L-Leu7。根據(jù)第7位氨基酸的類(lèi)型，surfactin分為A（L-Leu）、B（L-Val）和C（L-Ile）三種類(lèi)型，每種類(lèi)型因脂肪酸肽鏈長(zhǎng)度不同形成同系物。兩個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基Glu和Asp為極性親水部位，其他氨基酸殘基和脂肪酸鏈組成疏水結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)決定了surfactin具有兩親性和極高的表面活性。
濃度為40 mg/L的surfactin可以將水的表面張力從72 mN/m降低到27 mN/m。這優(yōu)越的表面活性和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)類(lèi)型賦予surfactin多樣的生物活性，包括抗細(xì)菌、抗真菌、抗炎、溶栓、抗支原體、抗高膽固醇、抗病毒、抗癌和對(duì)胰島素抗性的改善等，使surfactin廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品、農(nóng)業(yè)和環(huán)境治理等領(lǐng)域。Surfactin通過(guò)損傷病原菌細(xì)胞膜引起細(xì)胞膜裂解或滲透壓失衡、抑制病原菌繁殖、誘導(dǎo)植株系統(tǒng)抗性和促進(jìn)生防菌株的定殖或生物膜形成等廣泛應(yīng)用于植物促生和生物防治。
前人研究發(fā)現(xiàn)番茄細(xì)菌性潰瘍病生防菌株B.velezensis 1B-23和Bacillus spp.1D-12產(chǎn)生的脂肽C13-surfactins A、C14-surfactins A和C15-surfactins A均能抑制病原菌Clavibactermichigan sub（Cmm98-1）的生長(zhǎng)。B.velezensis MS20菌株產(chǎn)生的surfactin具有抑制立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）菌絲生長(zhǎng)的特性，用surfactin處理感染了R.solani的玉米植株，能有效降低玉米紋枯病的發(fā)病率，經(jīng)檢測(cè)抗性玉米植株細(xì)胞產(chǎn)生的防御酶含量相對(duì)提高，說(shuō)明surfactin誘導(dǎo)了玉米植株的系統(tǒng)性抗性。從B.pumilus W-7菌株發(fā)酵液提取的surfactins和fengycin B，通過(guò)協(xié)同作用可有效降低馬鈴薯晚疫病的發(fā)病率。
Fengycin B通過(guò)誘導(dǎo)菌絲變形、氧化損傷和線粒體功能障礙抑制P.infestans菌絲體菌絲生長(zhǎng)；surfactin通過(guò)加強(qiáng)植株防御基因（pod、pal和cat）表達(dá)，提高了POD、PAL和CAT的酶活，誘導(dǎo)馬鈴薯的植株防御反應(yīng)以抵抗晚疫病的發(fā)生。但是，野生菌surfactin產(chǎn)量低（一般不到1 g/L），雖然通過(guò)基因工程改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化，目前已報(bào)道產(chǎn)量達(dá)到了16.7 g/L，但是仍存在生產(chǎn)成本高和產(chǎn)量低的問(wèn)題，是工業(yè)化生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用的技術(shù)瓶頸。
Surfactin產(chǎn)生菌包括枯草芽胞桿菌（B.subtilis）、貝萊斯芽胞桿菌（B.velezensis）、解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）、暹羅芽胞桿菌（B.siamensis）、地衣芽胞桿菌（B.licheniformis）和短小芽胞桿菌（B.pumillus）等多種芽胞桿菌。不同菌株產(chǎn)生的surfactin類(lèi)型不同、脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度也不同，故生物活性也有所差異。鑒于芽胞桿菌產(chǎn)surfactin類(lèi)型和功能的特異性，以及目前實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的技術(shù)瓶頸，從環(huán)境中分離篩選優(yōu)良的產(chǎn)surfactin出發(fā)菌株，進(jìn)而通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)和生產(chǎn)工藝優(yōu)化，以及深入解析surfactin的生物活性機(jī)制具有重要的理論意義和潛在的巨大實(shí)際經(jīng)濟(jì)效益。
本研究利用選擇性分離技術(shù)從植物根際篩選獲得surfactin高產(chǎn)菌株C5A-1，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)確定了該菌株的分類(lèi)地位，通過(guò)全基因組測(cè)序分析和MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定所產(chǎn)surfactin的類(lèi)型，并采用多種植物檢測(cè)了該菌所產(chǎn)的surfactin的促生功能。研究結(jié)果豐富了脂肽產(chǎn)生菌資源，為通過(guò)合成生物學(xué)提高surfactin產(chǎn)量提供了優(yōu)良的底盤(pán)細(xì)胞工廠，為深入研究surfactin生物合成調(diào)控機(jī)制和生防促生機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。
Surfactin是芽胞桿菌屬多個(gè)種類(lèi)產(chǎn)生的次級(jí)代謝活性物質(zhì)。我們通過(guò)選擇性分離獲得surfactin產(chǎn)生菌C5A-1，利用16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析、全基因組平均核苷酸一致性分析和數(shù)字DNA-DNA雜交確定了C5A-1為芽胞桿菌屬貝萊斯種的一株新菌株。目前surfactin的工業(yè)化生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用的技術(shù)瓶頸是產(chǎn)量低和成本高。從環(huán)境中分離的野生菌的surfactin產(chǎn)量一般低于1 g/L，如模式貝萊斯芽胞桿菌FZB42為505 mg/L，生防貝萊斯芽胞桿菌BBC047和BBC025分別為633 mg/L和405 mg/L。我們從楊樹(shù)根際土中分離獲得的C5A-1產(chǎn)surfactin高達(dá)1 208.16 mg/L，為通過(guò)代謝工程改善surfactin產(chǎn)量提供了優(yōu)良的底盤(pán)菌株。Surfactin的結(jié)構(gòu)一方面取決于7肽頭部氨基酸類(lèi)型，另一方面取決于脂肪酸類(lèi)型和C鏈長(zhǎng)度，脂肪酸鏈的長(zhǎng)度為C12-C17不等。對(duì)surfactin理化性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，在同系物C12-C15中，表面活性隨著碳鏈長(zhǎng)度的減小而降低（C12為32.2 mN/m），臨界膠束濃度值（CMC）從C12的0.35 mmol/L下降到C15的0.08 mmol/L，膠束聚集數(shù)的范圍從C12的4.7 nm升高到C15的5.7 nm。我們采用酸沉淀法制備C5A-1的發(fā)酵液粗提物，利用MALDI-TOF MS分析證實(shí)該菌主要產(chǎn)C14-和C15-surfactin A，為surfactin的功能研究和實(shí)際應(yīng)用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
結(jié)論
Surfactin肽段的合成是由次級(jí)代謝基因簇編碼的非核糖體合成多肽（NRPS）完成的。NRPS是一種由重復(fù)模塊組成的多模塊巨型酶復(fù)合體，功能是將特定的氨基酸結(jié)合到肽骨架中。每個(gè)模塊可以分解為以下3個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域：腺苷酸（A）結(jié)構(gòu)域、巰基化（T）結(jié)構(gòu)域（也稱(chēng)肽基載體蛋白，PCP）和縮合（C）結(jié)構(gòu)域。A結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)識(shí)別、選擇并激活特定氨基酸，并通過(guò)與ATP的反應(yīng)催化特定氨基酸轉(zhuǎn)化為氨基?；佘账?；活化的氨基酸以硫酯的形式共價(jià)結(jié)合到T結(jié)構(gòu)域的柔性輔基4′-磷酸泛酰巰基乙胺基臂上，形成氨?；?S-載體復(fù)合物；C結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)催化新生肽和相鄰模塊攜帶的氨基酸之間形成肽鍵，并允許隨后延伸鏈移位到下一個(gè)模塊。部分模塊內(nèi)部還催化修飾氨基酸的差向異構(gòu)化（E）結(jié)構(gòu)域，肽鏈延伸循環(huán)結(jié)束后，末端硫酯酶（TE）結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)釋放線性肽段，并催化肽段內(nèi)部的環(huán)化。Surfactin的啟動(dòng)模塊采用C-A-T結(jié)構(gòu)，而非經(jīng)典的A-T結(jié)構(gòu)，該模塊包含一個(gè)特殊的C-結(jié)構(gòu)域，稱(chēng)為C-起始（Cs）結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)已活化脂肪酸與第一個(gè)氨基酸殘基連接，起始肽段的合成。我們利用Antismash分析C5A-1的次級(jí)代謝基因簇，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)surfactin的NRPS酶由srfA/lic操縱子，包含srfAA/licA、srfAB/licB、srfAC/licC和srfATE四個(gè)結(jié)構(gòu)基因，預(yù)測(cè)會(huì)產(chǎn)生線性7肽（FA-L-Glu1-L-Leu2-D-Leu3-L-Val4-L-Asp5-D-Ley6-L-Leu7）；SrfAC的TE結(jié)構(gòu)域會(huì)催化線性脂肽釋放，并催化Leu7與β-羥基脂肪酸的羥基之間形成內(nèi)酯鍵環(huán)化短肽。深入分析基因簇內(nèi)容也包含了輔助surfactin合成基因、調(diào)控基因hxlR，以及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因等。我們對(duì)C5A-1的全基因組測(cè)序和次級(jí)代謝產(chǎn)物分析為基因工程改造法提高surfactin的產(chǎn)量提供了有利的遺傳信息。
由于具有親水的氨基酸頭部和疏水的脂肪酸鏈尾巴這一特殊的結(jié)構(gòu)特征，surfactin具有極強(qiáng)的表面活性和多樣的生物活性，在化妝品、食品、醫(yī)藥、農(nóng)林業(yè)及環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。不斷增長(zhǎng)的人口對(duì)糧食的需求不斷增加，給農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)帶來(lái)了額外的負(fù)擔(dān)。化學(xué)農(nóng)藥、殺菌劑、化肥和高育種作物品種通常用于提高作物生產(chǎn)力，然而，化學(xué)品的過(guò)度開(kāi)發(fā)及其在環(huán)境中的持續(xù)存在對(duì)土壤、水和空氣產(chǎn)生了有害影響，從而擾亂了食物鏈和生態(tài)系統(tǒng)。農(nóng)用化學(xué)品、農(nóng)藥、金屬和碳?xì)浠衔镙^低的水溶性和較高的疏水性使它們能夠附著在土壤顆粒上，從而在環(huán)境中繼續(xù)存在。化學(xué)農(nóng)藥，如有機(jī)磷、有機(jī)氯和氨基甲酸酯，經(jīng)常用于保護(hù)農(nóng)產(chǎn)品。通過(guò)surfactin或產(chǎn)生surfactin和降解農(nóng)藥的微生物，可以將黏附在土壤顆粒上的疏水污染物溶解或解吸。同時(shí)，surfactin對(duì)多種植物病原體具有廣譜抗菌活性而被廣泛研究。最新研究表明采用葉面噴施surfactin方式處理小白菜，可以顯著提高其株高、根長(zhǎng)以及葉綠素含量，初步揭示了surfactin作為植物生長(zhǎng)刺激劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。我們利用盆栽實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了C5A-1發(fā)酵液surfactin提取物對(duì)毛白楊組培苗、玉米和大豆幼苗生長(zhǎng)的調(diào)控功能，結(jié)果顯示，不同濃度的surfactin對(duì)3種植物幼苗均具有顯著的促生功能，該研究結(jié)果不但為C5A-1作為菌劑產(chǎn)品或其產(chǎn)物surfactin作為植物生長(zhǎng)刺激劑應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為深入解析植物-微生物互作機(jī)制的解析提供新視角。
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