工程菌大腸桿菌EcN FGF19-01培養(yǎng)、生長(zhǎng)曲線測(cè)定及改善慢性結(jié)腸炎作用研究（一）
炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種特發(fā)腸道的慢性疾病，主要包括克羅恩病（Crohn disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC），目前病因尚不明確，臨床常表現(xiàn)為急性疼痛、腹瀉和血便等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來IBD的發(fā)病率和流行率在世界各地呈上升趨勢(shì)，目前IBD以藥物治療為主，其主要用于緩解或維持緩解癥狀，目前尚未有完全治愈的方法。
IBD臨床治療藥物主要有水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類和免疫抑制劑類。水楊酸類藥物（如5-氨基水楊酸）可通過降低腸內(nèi)促炎癥因子的釋放發(fā)揮抗炎作用，臨床常用于輕度至中度癥狀的腸炎患者，但水楊酸類藥物具有較嚴(yán)重的胃腸道等不良反應(yīng)，也有報(bào)道稱可能引起腎損傷；糖皮質(zhì)激素類藥物（如氫化可的松、潑尼松）通過抑制致炎物質(zhì)（如前列腺素、白三烯）的釋放緩解炎癥，臨床常用于中度至重度癥狀的腸炎患者，但長(zhǎng)期或大量服用易產(chǎn)生耐藥性及多種不良反應(yīng)；免疫抑制劑類藥物如硫唑嘌呤、腫瘤壞死因子α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）抑制劑，可抑制炎性細(xì)胞增殖，臨床主要用于誘導(dǎo)緩解或維持緩解臨床治療困難的激素依賴性克羅恩病（Crohn's disease,CD），但患者服用后容易引起惡心、嘔吐和腹瀉等不良反應(yīng)?？傊?，盡管水楊酸類藥物、激素類藥物或免疫抑制劑類藥物等能緩解IBD的臨床癥狀，但均存在停藥易復(fù)發(fā)、長(zhǎng)期使用患者依從性低等不足。
近年來大量研究顯示，補(bǔ)充益生菌或工程菌在IBD的治療中取得了較好的效果，能有效緩解其臨床癥狀。益生菌憑借其固有的腸道親和力，被視為改善腸道健康的潛力候選者。然而，天然菌株在治療上的效果往往有限。合成生物學(xué)技術(shù)的興起為開發(fā)基因工程細(xì)菌提供了創(chuàng)新途徑，有望成為破解這些難題的新策略。大腸桿菌E.coli Nissle 1917（EcN）是自1917年發(fā)現(xiàn)以來已在人類中使用來治療各種胃腸道和代謝疾病，包括炎癥性腸病、腸易激綜合征和苯丙酮尿癥等。EcN菌不會(huì)在人體中定植，且人體攝入一周后糞便中即檢測(cè)不到該菌的存在，故具有良好的安全性和遺傳易處理性。而且，EcN菌已被批準(zhǔn)使用作為底盤菌開發(fā)特異性的治療各種疾病的活菌藥物。例如，Praveschotinunt等人構(gòu)建了誘導(dǎo)表達(dá)卷曲融合的三葉因子（TFFs）的工程化EcN，利用阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑成功促使EcN分泌TFFs，并顯著緩解了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。
人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子19(FGF19)是一種24 kDa的蛋白質(zhì)，是在回腸末端特異性合成并分泌的細(xì)胞因子，屬于FGFs的特殊成員之一，與嚙齒動(dòng)物體內(nèi)FGF15同源；兩者的組織分布相似，有時(shí)被稱為FGF15/19。FGF19最初是在胎兒大腦中發(fā)現(xiàn)的，被認(rèn)為在早期神經(jīng)元發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。后續(xù)在表達(dá)FGF19的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)其代謝率增加和肥胖減少現(xiàn)象，揭示了FGF19參與代謝調(diào)節(jié)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FGF19參與膽汁酸生物合成途徑的反饋抑制。FGF15/19在回腸中響應(yīng)膽汁酸的吸收而表達(dá)分泌，膽汁酸釋放至回腸結(jié)合法尼酯X受體（FXR），進(jìn)而促進(jìn)FGF15/19的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；FGF19進(jìn)入門靜脈循環(huán)，通過降低肝臟CYP7A1（催化膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)?α羥基膽固醇，膽汁酸合成的第一限速步驟）活性，從而負(fù)反饋抑制肝臟新膽汁酸合成。
研究表明，DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，回腸FGF15表達(dá)顯著下降（NatureCommunications 2014,5:4573）；接受回腸切除術(shù)的患者或克羅恩病人血清FGF19顯著降低（Journal of Crohns＆amp;Colitis 2015,9:125-31）。研究表明，小鼠敲除FGF15、FGFr4或Klb，將導(dǎo)致糞便中膽汁酸含量升高，誘發(fā)腹瀉（Cell Metabolism 2005,2:217-25）。腸炎狀態(tài)下腸道FXR表達(dá)顯著下降，破壞膽汁酸負(fù)反饋通路FXR-FGF19/15，補(bǔ)充低劑量的人重組FGF19恢復(fù)腸道膽汁酸內(nèi)穩(wěn)態(tài)，緩解DSS誘導(dǎo)的慢性腸炎的發(fā)生發(fā)展（NatureCommunications 2020,11:3612）。以上研究說明FGF19表達(dá)分泌異常及其膽汁酸合成代謝失調(diào)是慢性腸炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，通過基因和藥物干預(yù)或增強(qiáng)FGF19作用似乎是一種潛在的改善慢性結(jié)腸炎的有效手段。
1、大腸桿菌EcN的培養(yǎng)
利用LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌。LB液體培養(yǎng)基的配制（1L）：在950mL ddH2O中加入胰化蛋白胨（tryptone）10g；酵母提取物（yeast extract）5g；NaCl 10g。用1M的NaOH調(diào)節(jié)pH值到7.0，固體培養(yǎng)基中額外添加15g瓊脂粉；ddH2O定容至1L。121℃，20min高壓滅菌，細(xì)菌培養(yǎng)全程在超凈臺(tái)中操作，大腸桿菌按照1∶100比例接種，8-12h生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，經(jīng)離心收集，用含20%甘油的PBS凍存細(xì)菌。
活細(xì)菌濃度測(cè)定：細(xì)菌經(jīng)37度水浴解凍，利用PBS按10倍梯度稀釋菌液，分別稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后將10-7和10-8的兩個(gè)濃度菌液涂布到固體培養(yǎng)皿中；24h之后計(jì)算菌落數(shù)目，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出細(xì)菌原液的活菌數(shù)。以菌落形成單位（CFU，Colony-Forming Units）表示單位體積中的細(xì)菌的群落總數(shù)。
2、表達(dá)FGF19工程化EcN的設(shè)計(jì)
細(xì)菌內(nèi)源性FnrS的啟動(dòng)子（PfnrS）在氧氣存在下是無活性的，但在厭氧或微氧條件下與FNR結(jié)合被激活；基于此，采用了PfnrS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)FGF19的表達(dá)，從而使工程菌被口服灌胃后在腸道深處無氧/微氧情況下得以啟動(dòng)目標(biāo)基因的表達(dá)。人源FGF19基因的CDS序列經(jīng)密碼子優(yōu)化（E.coli Codon Usage Analyzer 2.1）后連接細(xì)菌內(nèi)源ompA的信號(hào)肽序列，然后與rrnB T1終止子序列一起組成PfnrS+ompA信號(hào)肽+FGF19 CDS+rrnB T1終止子的表達(dá)框，表達(dá)框全長(zhǎng)1020 bp核苷酸。該設(shè)計(jì)將促使工程菌在腸道內(nèi)低氧環(huán)境下能夠高效表達(dá)FGF19，同時(shí)分泌至細(xì)胞外面，有效接觸作用腸道黏膜，工程菌工作模式見圖1。
3、工程化大腸桿菌EcN FGF19-01構(gòu)建步驟
細(xì)菌基因編輯采用雙質(zhì)粒系統(tǒng)（pCas,addgene#62225;pTargetF,addgene#62226）。選擇EcN基因組的exo/cea基因位點(diǎn)作為編輯插入?yún)^(qū)域，因?yàn)樵撐稽c(diǎn)被證明是安全位點(diǎn)，不會(huì)誘發(fā)基因毒性和不影響細(xì)菌自身生存。首先把pCas質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)入EcN感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌株，命名為EcN Cas9+；然后構(gòu)建帶有exo/cea-sgRNA、上下同源臂和PfnrS-FGF19表達(dá)框序列的pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19重組質(zhì)粒；步驟如下：利用gRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站工具（https://www.genscript.com/gRNA-design-tool.html），針對(duì)EcN基因組的exo/cea基因位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)得到20 bp的gRNA序列（GGAACTACATTAGGTATCTG），然后設(shè)計(jì)帶有SpeI/PstI雙酶切位點(diǎn)的引物exo/cea-sgRNA-F和exo/cea-sgRNA-R，以pTargetF質(zhì)粒為模版，PCR擴(kuò)增得到exo/cea-sgRNA序列，然后插入pTargetF質(zhì)粒得到pTargetF-exo/cea-sgRNA重組質(zhì)粒；委托鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成上述1020 bp PfnrS-FGF19表達(dá)框核苷酸序列；設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增exo/cea位點(diǎn)的上游和下游同源臂序列，命名為exo/cea-LHA、exo/cea-RHA，長(zhǎng)度分別為1040 bp、1010 bp；通過Overlap-PCR將所述1020 bpPfnrS-FGF19表達(dá)框核苷酸序列和exo/cea-LHA、exo/cea-RHA序列進(jìn)行連接，再通過BglII/XhoI雙酶切、連接插入至重組質(zhì)粒pTargetF-exo/cea-sgRNA，最終得到重組質(zhì)粒pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19。
進(jìn)一步將重組質(zhì)粒pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19電轉(zhuǎn)化至EcN Cas9+感受態(tài)菌株中；通過在LB平皿固體培養(yǎng)基中添加10 mM的阿拉伯糖和Spe、Kan雙抗性進(jìn)行菌株篩選，陽性菌株，經(jīng)過基因編輯后，然后從LB平皿中挑取單菌落；然后通過PCR鑒定陽性菌株，以及測(cè)序篩選陽性突變菌株。
最后，將得到的編輯成功的陽性菌株進(jìn)行pCas和pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19質(zhì)粒消除。將細(xì)菌接種至1.5 mL含有卡那霉素（50μg/mL）和IPTG（0.5 mM）的LB培養(yǎng)基中，孵育8-16h，然后稀釋，涂布至含有卡那霉素（50μg/mL）平板上。然后挑單克隆菌株進(jìn)行PCR鑒定，篩選消除了pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19質(zhì)粒的陽性菌株。最后將菌株接種至無抗性的LB培養(yǎng)基，37度培養(yǎng)過夜，然后稀釋，涂布至無抗性平板上。然后挑單克隆菌株進(jìn)行PCR鑒定。最終將得到編輯成功且不帶pCas和pTargetF-exo/cea-sgRNA-FGF19質(zhì)粒的陽性工程化大腸桿菌株，并命名為EcN FGF19-01；將野生型菌株命名為EcN WT。
4、工程菌EcN FGF19-01和野生型菌株EcN WT的生長(zhǎng)曲線測(cè)定
將EcN FGF19-01和EcN WT單克隆菌株培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中過夜，于第二天早上，分別按照1∶100比例接種，然后分別在0、2、4、6、8、10和12h時(shí)測(cè)定OD600值，并繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，EcN FGF19-01和EcN WT菌株生長(zhǎng)曲線無顯著差異。
5、RNA提取及實(shí)時(shí)定量熒光PCR
總RNA抽提按照Trizol試劑（Invitrogin）說明書操作步驟進(jìn)行，并用RNA純化試劑盒TURBO DNA-freeTM Kit（AM1907，Applied Biosystems）對(duì)提取的總RNA進(jìn)行純化去除DNA，操作參照說明書進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（EBI，7900）上完成。10μL反應(yīng)體系為：5μL SYBR Premix、4μL DNA、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物。程序?yàn)椋?5°C 3 min，（95°C 20 s、60°C 20 s、72°C 20 s+讀板）40個(gè)循環(huán)，（55°C升溫到95°C，每0.5°C讀5 s）溶解曲線。用細(xì)菌總16S作為內(nèi)參進(jìn)行樣品間的校正，結(jié)果用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算，檢測(cè)突變菌株中FGF19的表達(dá)。結(jié)果顯示，在無氧條件下EcN FGF19-01菌株顯著高表達(dá)FGF19 mRNA。
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