3株奧默柯達(dá)酵母生長(zhǎng)曲線、pH耐受性、最適生長(zhǎng)溫度測(cè)定及對(duì)醬油香氣和滋味影響（一）
摘要
柯達(dá)酵母屬為華中地區(qū)醬醪醪優(yōu)勢(shì)菌屬，為探究其對(duì)高鹽稀態(tài)醬油風(fēng)味和品質(zhì)的影響，從醬醪醪中共分離鑒定共得到10株奧默柯達(dá)酵母，且10株酵母均無溶血性。篩選其中3株乙醇積累能力較強(qiáng)的菌株K02、KD13和KD28，對(duì)其生長(zhǎng)曲線、pH耐受性、最適生長(zhǎng)溫度進(jìn)行研究。3株菌在160g/L鹽質(zhì)量濃度、pH值為4~6、溫度為30℃的條件下生長(zhǎng)良好。進(jìn)一步將高鹽下乙醇及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)代謝能力最強(qiáng)的菌株KD13在醬油釀造中進(jìn)行添加發(fā)酵應(yīng)用，理化指標(biāo)分析顯示，KD13對(duì)醬油的還原糖、總酸、氨態(tài)氮含量影響不大，乙醇含量較對(duì)照樣提升了11.4%。利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析檢出60種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，添加KD13發(fā)酵的醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量較對(duì)照組提升22.18%。利用正交偏最小二乘法判別分析篩選出添加醬油及對(duì)照樣中變量投影重要性分析值大于1的差異風(fēng)味物質(zhì)共計(jì)23種，差異風(fēng)味物質(zhì)隨時(shí)間變化的熱圖分析顯示，KD13對(duì)醬油中乳酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇以及4-乙基愈創(chuàng)木酚、3-甲硫基丙醛等醬油特征風(fēng)味物質(zhì)有明顯提升作用。感官評(píng)價(jià)分析表明，奧默柯達(dá)酵母對(duì)醬油香氣和滋味有增益作用。該研究為奧默柯達(dá)酵母在醬油釀造中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
發(fā)酵3~4月的高鹽稀態(tài)醬醪醪和成品曲，取自華中地區(qū)某醬油廠。
酵母基因組DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；酵母26S rDNA PCR試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；2-甲基-3-庚酮（內(nèi)標(biāo)物），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；其他藥品試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
溶血性試驗(yàn)菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），由湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心保藏。
培養(yǎng)基（g/L）：100、160 NaCl的豆芽汁培養(yǎng)基，100、160 NaCl的YPD培養(yǎng)基，脫纖維羊血培養(yǎng)基均參考文獻(xiàn)配制。
1.2儀器與設(shè)備
E200型顯微成像系統(tǒng)，尼康映像儀器（上海）有限公司；PE28型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；722型分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；VERITI型梯度PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)應(yīng)用生物有限公司；DYY-12型電泳儀，北京市六一儀器廠；Champ Gel 5000 Plus型凝膠成像系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18型色譜柱，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；436GC/EVOQ TQ/PAL型氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Bruker Daltonics公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取針，美國(guó)Supelco公司；DB-5MS型色譜柱，美國(guó)Agilent公司。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1生香酵母的篩選
發(fā)酵3~4月的高鹽稀態(tài)醬醪醪梯度稀釋后，涂布于含有100 g/L NaCl的豆芽汁固體平板上，30℃培養(yǎng)48~72 h，根據(jù)形態(tài)挑取酵母單菌落，稀釋純化3次，獲得純培養(yǎng)菌株，接種至豆芽汁培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72 h，進(jìn)行香氣嗅聞。
1.3.2生香酵母的鑒定
采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取酵母模板DNA，PCR擴(kuò)增，采用20μL體系：模板DNA 1μL，酵母通用引物NL-1（5'-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3'）和NL-4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）各2μL，Taq聚合酶0.5μL，MgCl?溶液1μL，10×PCR buffer 1μL，dNTP 0.5μL，dd H?O補(bǔ)足至20μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次，72℃末端延伸7 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度。測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，結(jié)果登錄NCBI進(jìn)行同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.3.3 K.ohmeri產(chǎn)乙醇能力測(cè)定
調(diào)整種子液濃度為10?CFU/mL，以1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種至豆芽汁培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d，測(cè)定乙醇含量。篩選產(chǎn)乙醇能力最高的3株K.ohmeri進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵性能研究。
1.3.4 K.ohmeri溶血性實(shí)驗(yàn)
脫纖維羊血培養(yǎng)基冷卻至50℃時(shí)添加5%的脫纖維羊血，搖勻后倒入無菌平板冷卻備用。將活化菌無菌操作在平板上劃S形曲線，陽性對(duì)照菌培養(yǎng)條件為37℃、24 h，測(cè)試菌及陰性對(duì)照菌培養(yǎng)條件為30℃、48 h。
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