黑曲霉中幽黑素合成途徑、生產(chǎn)、純化及對(duì)UV-C輻射的防護(hù)能力
研究背景：載人太空任務(wù)面臨的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是宇宙輻射和太陽(yáng)輻射的防護(hù)。地球的磁場(chǎng)可以保護(hù)我們免受這些輻射的傷害，但在太空旅行中，宇航員需要額外的防護(hù)措施。黑曲霉是一種已知的高輻射抗性真菌，廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域。它能夠?qū)⒖稍偕参锷镔|(zhì)轉(zhuǎn)化為多種產(chǎn)品，如有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、酶和次級(jí)代謝產(chǎn)物。黑曲霉是一種已知的高輻射抗性真菌，廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域。它能夠?qū)⒖稍偕参锷镔|(zhì)轉(zhuǎn)化為多種產(chǎn)品，如有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、酶和次級(jí)代謝產(chǎn)物。此外，黑曲霉在模擬微重力條件下生長(zhǎng)良好，其孢子對(duì)空間輻射（包括UV-C、宇宙輻射和X射線）具有極高的抵抗力。幽黑素是一種具有抗氧化和自由基清除特性的色素，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有高度的異質(zhì)性，能夠有效吸收和分散各種形式的輻射，包括紫外線和電離輻射。本研究探索了黑曲霉生產(chǎn)幽黑素的能力，研究中使用了黑曲霉的不同菌株，并通過(guò)在培養(yǎng)基中添加L-酪氨酸來(lái)誘導(dǎo)幽黑素的過(guò)量生產(chǎn)。
通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)敲除黑曲霉中的hppD和hmgA基因，以增強(qiáng)幽黑素的生產(chǎn)。通過(guò)酸化和冷凍干燥等步驟從培養(yǎng)液中提取幽黑素。使用紫外-可見(jiàn)光譜（UV-Vis）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和拉曼光譜等方法對(duì)幽黑素進(jìn)行表征。通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)評(píng)估幽黑素的抗氧化能力，并通過(guò)UV-C輻射實(shí)驗(yàn)評(píng)估其輻射防護(hù)效果。并通過(guò)誘導(dǎo)過(guò)量生產(chǎn)來(lái)提高產(chǎn)量。同時(shí)，評(píng)估幽黑素對(duì)非電離輻射（如UV-C）的防護(hù)效果，并與合成的幽黑素（PyoSyn）進(jìn)行比較。此外，研究還探討了幽黑素在生物技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)和太空探索中的潛在應(yīng)用價(jià)值。研究成功在黑曲霉中誘導(dǎo)生產(chǎn)了幽黑素（PyoFun），并通過(guò)光譜分析確認(rèn)了其結(jié)構(gòu)。PyoFun表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗氧化能力，其自由基清除能力約為抗壞血酸的80%。在UV-C輻射實(shí)驗(yàn)中，PyoFun對(duì)UV-C輻射具有顯著的防護(hù)效果，尤其是在缺乏DHN-黑色素的菌株中，PyoFun的防護(hù)效果更為顯著。
丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（oCelloScope?）的應(yīng)用
oCelloScope?被用于評(píng)估黑曲霉孢子在經(jīng)過(guò)UV-C輻射后的生存能力。oCelloScope在本研究中主要應(yīng)用于孢子萌發(fā)與菌絲形成的觀察。在輻射實(shí)驗(yàn)后，使用oCelloScope?在22°C下對(duì)孢子進(jìn)行48小時(shí)的觀察。該設(shè)備通過(guò)數(shù)字時(shí)間延遲顯微技術(shù)生成高分辨率的微生物圖像，并通過(guò)z軸掃描創(chuàng)建一系列圖像。oCelloScope?利用內(nèi)置的SESA真菌算法，通過(guò)分析z軸圖像上的像素變化，量化孢子萌發(fā)和菌絲形成的動(dòng)態(tài)過(guò)程。這種方法能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)孢子的生長(zhǎng)情況，為評(píng)估輻射對(duì)孢子生存能力的影響提供了直觀的數(shù)據(jù)支持。通過(guò)oCelloScope?的應(yīng)用，研究人員能夠更準(zhǔn)確地評(píng)估黑曲霉孢子在輻射條件下的生存能力，以及幽黑素對(duì)輻射防護(hù)的實(shí)際效果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
通過(guò)基因工程手段，成功利用黑曲霉（Aspergillus niger）生產(chǎn)并分泌幽黑素（pyomelanin），并對(duì)其抗氧化和輻射防護(hù)能力進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估。黑曲霉菌株OS4.3通過(guò)敲除hmgA基因，能夠高效生產(chǎn)并分泌幽黑素（PyoFun）。該色素主要存在于細(xì)胞外，便于純化，且產(chǎn)量較高（1.5 g/L培養(yǎng)液）。通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜（UV-Vis）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和拉曼光譜分析，確認(rèn)了PyoFun的化學(xué)結(jié)構(gòu)與合成的幽黑素（PyoSyn）一致，均為黑色素類(lèi)物質(zhì)。PyoFun表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗氧化能力，其自由基清除能力約為抗壞血酸的80%。純化的PyoFun比未經(jīng)純化的培養(yǎng)上清液具有更高的自由基清除活性，表明純化過(guò)程對(duì)提高抗氧化能力至關(guān)重要。PyoFun對(duì)UV-C輻射具有顯著的防護(hù)效果，尤其是在缺乏DHN-黑色素的菌株（MA93.1）中，其防護(hù)效果更為顯著。在1,038 J/m2的UV-C輻射劑量下，PyoFun顯著提高了孢子的生存率，而合成的PyoSyn則未表現(xiàn)出顯著的防護(hù)效果。
圖1、研究的實(shí)驗(yàn)工作流程圖。展示了研究的整體流程，包括黑曲霉菌株的培養(yǎng)、幽黑素（PyoFun）的生產(chǎn)、純化、光譜分析、抗氧化測(cè)試以及輻射屏蔽測(cè)試等步驟。
圖2、A）幽黑素生物合成途徑；（B）黑曲霉菌株的生長(zhǎng)表型。圖(A)展示了黑曲霉中幽黑素形成的生物合成途徑，包括關(guān)鍵基因和代謝產(chǎn)物。圖(B)展示了在含有L-酪氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，野生型和基因敲除突變株（hppD和hmgA）的生長(zhǎng)表型差異。
圖3、黑曲霉中幽黑素的生產(chǎn)和純化。展示了黑曲霉菌株OS4.3在含有L-酪氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，通過(guò)酸化和冷凍干燥步驟純化出的幽黑素（PyoFun）的過(guò)程。
圖4、幽黑素的物理化學(xué)特性。展示了PyoFun在不同溶劑中的溶解性測(cè)試結(jié)果，以及在過(guò)氧化氫處理后的褪色情況，表明PyoFun具有抗氧化活性。
圖5、幽黑素對(duì)UV-C輻射的防護(hù)能力。應(yīng)用ocelloScope展示了黑曲霉野生型（N402）和DHN-黑色素缺陷型（MA93.1）孢子在經(jīng)過(guò)PyoFun和PyoSyn保護(hù)后，對(duì)UV-C輻射的耐受性的生長(zhǎng)過(guò)程。結(jié)果顯示，PyoFun顯著提高了孢子的生存率，尤其是在DHN-黑色素缺陷型菌株中。
總結(jié)
黑曲霉（Aspergillus niger）作為一種細(xì)胞工廠用于生產(chǎn)具有紫外線（UV-C）輻射屏蔽活性的幽黑素（pyomelanin）。黑曲霉（Aspergillus niger）是一種已知的高輻射抗性真菌，廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域，是生產(chǎn)黑色素的候選菌株。本研究通過(guò)在重組的ΔhmgA突變株（OS4.3）中誘導(dǎo)過(guò)量生產(chǎn)色素，研究了黑曲霉中真菌幽黑素（PyoFun）的生產(chǎn)。通過(guò)三種光譜方法對(duì)PyoFun色素進(jìn)行了表征，并通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)評(píng)估了其抗氧化特性。此外研究人員還評(píng)估了PyoFun對(duì)非電離輻射（單色UV-C）的保護(hù)效果，并將其與合成的對(duì)照幽黑素（PyoSyn）進(jìn)行了比較。oCelloScope?在本研究中被用于評(píng)估黑曲霉孢子在經(jīng)過(guò)UV-C輻射后的生存能力，使用oCelloScope?在22°C下對(duì)孢子進(jìn)行48小時(shí)的觀察，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)孢子的生長(zhǎng)情況，為評(píng)估輻射對(duì)孢子生存能力的影響提供了直觀的數(shù)據(jù)支持。結(jié)果證實(shí)了通過(guò)誘導(dǎo)過(guò)量生產(chǎn)在黑曲霉中成功生產(chǎn)了PyoFun。光譜方法的表征確認(rèn)了PyoFun的存在，DPPH實(shí)驗(yàn)顯示了其強(qiáng)大的抗氧化特性。此外PyoFun在抵御輻射誘導(dǎo)的應(yīng)激方面表現(xiàn)出高度的保護(hù)效果，超過(guò)了PyoSyn的保護(hù)效果。本研究結(jié)果表明，PyoFun作為一種生物屏蔽劑對(duì)抗有害輻射具有顯著潛力。值得注意的是，PyoFun是胞外合成的，這使其與其他真菌黑色素（如L-DOPA或DHN黑色素）不同，后者需要細(xì)胞裂解才能純化色素。這一特性使PyoFun成為生物技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)和太空工業(yè)的寶貴資源。然而仍需進(jìn)一步研究以評(píng)估其在干燥形式下以及對(duì)電離輻射的保護(hù)效果。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步探索PyoFun在干燥形式下的防護(hù)效果，以及其對(duì)電離輻射的防護(hù)能力。這項(xiàng)研究不僅展示了黑曲霉在生產(chǎn)具有輻射防護(hù)能力的幽黑素方面的潛力，還為未來(lái)的太空探索和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了新的思路。
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