大腸桿菌噬菌體Φ199一步生長曲線、與鹽酸克林霉素體外聯(lián)合應(yīng)用效果（一）
摘要：旨在探究大腸桿菌噬菌體Φ199與鹽酸克林霉素體外聯(lián)合應(yīng)用的效果。對以大腸桿菌O157:H7為宿主菌的噬菌體Φ199的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，并對噬菌體Φ199與鹽酸克林霉素聯(lián)用抗菌效果進(jìn)行評估。結(jié)果：噬菌體Φ199是肌尾噬菌體，其頭部直徑約為50 nm，尾部長度約為100 nm；噬菌體Φ199能夠在40~60℃穩(wěn)定存活，并且在pH值3~12范圍內(nèi)保持活性，表明噬菌體Φ199具有較寬的溫度、酸堿耐受性；噬菌體Φ199的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為1，一步生長曲線顯示潛伏期為5 min，裂解期為5 min，裂解量為44，能夠在3 h內(nèi)抑制細(xì)菌生長；抗生素聯(lián)合應(yīng)用結(jié)果顯示，噬菌體Φ199與鹽酸克林霉素聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用，與效價(jià)為10^6~10^7 PFU/mL的噬菌體聯(lián)用時(shí)可將抗生素有效濃度降低至1/2 MIC，在與效價(jià)為10^8 PFU/mL的噬菌體聯(lián)用時(shí)可將抗生素有效濃度降低至1/4 MIC。
大腸桿菌O157:H7是一種重要的食源性致病菌，常通過消化道進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，定殖并破壞腸黏膜上皮細(xì)胞，通過產(chǎn)生志賀毒素引起細(xì)胞死亡并進(jìn)入血液循環(huán)，對機(jī)體造成損傷。大腸桿菌O157:H7主要傳染源是感染者和無癥狀攜帶者，通常能夠通過受污染的食物和水感染人，引起腹瀉、發(fā)熱、嘔吐等癥狀，具有較高的發(fā)病率和死亡率，是一種重要的人獸共患病原菌?？股厥侵委煷竽c桿菌O157:H7感染的主要手段，但是部分研究人員從環(huán)境和人體糞便樣本中分離到該菌耐藥菌株，這些耐藥菌株可能限制了抗生素治療的療效。自20世紀(jì)80年代，人們就發(fā)現(xiàn)對青霉素等抗生素具有耐藥性的大腸桿菌O157:H7菌株。近年來，隨著抗生素的普及，多重耐藥菌也逐漸增多，如今，人們能夠從奶牛等動(dòng)物體內(nèi)檢測出具有耐氨芐西林、頭孢菌素、卡那霉素等多種抗生素的多重耐藥大腸桿菌O157:H7菌株，這為該菌感染的進(jìn)一步防治帶來了挑戰(zhàn)。
噬菌體是一種在自然界中廣泛存在的微生物，作為細(xì)菌的天然克星，其具有動(dòng)態(tài)自適應(yīng)靶向能力、高度的物種特異性、良好的生物相容性以及能夠裂解耐藥細(xì)菌等優(yōu)勢。近年來，噬菌體治療的相關(guān)研究取得了一定進(jìn)展。一項(xiàng)研究表明，用噬菌體處理多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的傷口時(shí)表現(xiàn)出高達(dá)99%的愈合效率。此外，研究人員通過將3種針對O157:H7大腸桿菌的噬菌體混合成"雞尾酒"治療小鼠腸炎，顯著提高了小鼠存活率以及預(yù)后效果。這些試驗(yàn)都證明了噬菌體治療的可能性。然而，噬菌體和細(xì)菌始終處于競爭關(guān)系中，細(xì)菌可能在短時(shí)間內(nèi)通過修飾受體或其他突變機(jī)制逃避噬菌體的感染，獲得對噬菌體的抗性，導(dǎo)致單一的噬菌體無法徹底清除細(xì)菌感染。
基于抗生素和噬菌體對細(xì)菌不同的殺菌機(jī)制，臨床或試驗(yàn)中嘗試將抗生素和噬菌體聯(lián)合治療，與單純抗生素或噬菌體治療相比，可避免細(xì)菌對單純抗生素或單純噬菌體產(chǎn)生耐藥性，顯著提高患者的治愈比例，且通過正確的聯(lián)合用藥還能夠降低藥物的副作用，提高治療效果。本試驗(yàn)檢測了大腸桿菌噬菌體Φ199最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)、一步生長曲線等生物學(xué)特性，同時(shí)也檢測了大腸桿菌O157:H7對不同抗生素的耐藥性，在此基礎(chǔ)上探究了噬菌體與鹽酸克林霉素聯(lián)合用藥的效果。
1材料與方法
1.1材料
大腸桿菌O157:H7菌株為江蘇省疾病預(yù)防與控制中心惠贈(zèng)，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院人獸共患病實(shí)驗(yàn)室保存；噬菌體為實(shí)驗(yàn)室分離保存的肌尾科噬菌體Φ199；Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基購自海博生物技術(shù)有限公司；鹽酸克林霉素購自北京索萊寶科技有限公司。
1.2噬菌體效價(jià)測定
采用雙層平板法進(jìn)行噬菌體增殖。宿主菌O157:H7大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，取100μL菌液與100μL噬菌體混合均勻，加入45℃的Luria-Bertani(LB)半固體中，混勻后倒入LB平板。30℃過夜培養(yǎng)，待平板上長滿空斑后取出平板，加入5 mL SM液，4℃放置12 h。最后吸取SM液用0.22μm的濾膜過濾，所得濾液即為噬菌體裂解液，于4℃保存?zhèn)溆谩?
采用雙層平板法進(jìn)行噬菌體效價(jià)測定。上述噬菌體裂解液用SM液進(jìn)行10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度取100μL與100μL對數(shù)期大腸桿菌O157:H7混勻，加入45℃的LB半固體中，混勻后倒入LB平板。30℃過夜培養(yǎng)，第2天取出平板，計(jì)數(shù)噬菌斑為30~300之間的平板。重復(fù)以上操作3次，取平均數(shù)為對應(yīng)噬菌體的效價(jià)。
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