滸苔多糖降解微生物采集、分離、篩選、鑒定及生長曲線測定（一）
摘要：滸苔中含有大量的滸苔多糖，分解、利用及轉(zhuǎn)化滸苔多糖對藻類資源利用以及海洋碳循環(huán)具有重要意義。為篩選出能降解滸苔多糖的微生物，提高滸苔生物量的回收利用效率，本研究利用微生物分離鑒定以及基質(zhì)測試技術(shù)從滸苔綠潮中分離鑒定了浮游及滸苔附著微生物，成功地從分離到的菌株中篩選出能降解滸苔多糖的菌株，并選取黃桿菌Algibacter lectus S7和交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6作為代表菌株進行碳源利用譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黃桿菌Algibacter lectus S7可以分解利用滸苔多糖、木聚糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖；交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6可以分解利用滸苔多糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、木聚糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖和糊精。從生長曲線可見，兩菌株均能高效分解利用滸苔多糖，并分別揭示了兩菌株對碳源利用情況，為海洋微生物對滸苔多糖的分解代謝研究及工業(yè)上提高滸苔生物量回收利用效率提供菌種資源及碳源參考。
滸苔（Ulva prolifera，Enteromorpha prolifera），隸屬于綠藻門石莼科滸苔屬，俗稱“海青菜”“綠紫菜”，是生活在近海灘涂中的天然野生綠藻，也是我國東南沿海最常見的海洋綠藻之一。自2007年起，每年夏季我國黃海都會爆發(fā)由滸苔引發(fā)的大規(guī)模綠潮。其中，2008年青島暴發(fā)的滸苔綠潮是世界上最大的綠潮，影響海域超過2萬km2，實際覆蓋面積超過400 km2。大量漂浮滸苔遮蔽陽光，消耗水中氧氣，造成海洋生物死亡，對養(yǎng)殖業(yè)及海洋環(huán)境帶來極大的危害。為減少滸苔綠潮對海洋環(huán)境的污染，政府每年都要花費巨額資金，出動大量人力來打撈滸苔，同時面臨著提高滸苔生物量資源的回收利用效率問題。
滸苔多糖是滸苔生物量的主要成分，占滸苔干重的20%～70%。滸苔多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂等多種生理活性功能。而低分子量的滸苔寡糖具有更好的生物活性及水溶性，更廣泛地應(yīng)用于藥物及功能性食物中。同時，滸苔可作為生產(chǎn)生物柴油及生物乙醇的材料。目前對滸苔生物量的資源利用還存在成本高、轉(zhuǎn)化效率低的問題。因此，篩選出能高效降解滸苔多糖的微生物及酶類，加快多糖物質(zhì)的降解，是提高滸苔生物質(zhì)利用效率及實現(xiàn)資源轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，也是滸苔綠潮污染治理中重要的一環(huán)。
滸苔多糖主要成分為葡萄糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸等，并且含有以糖醛酸和硫酸基為主要結(jié)構(gòu)的水溶性多糖，其中糖醛酸和硫酸根的含量相對比較穩(wěn)定。目前對滸苔多糖降解微生物的研究還十分匱乏。Li等從腐爛滸苔綠藻表面底泥中分離到一株γ-變形菌門的交替單胞菌（Alteromonas sp.A321），發(fā)現(xiàn)它能產(chǎn)生某種可分解滸苔多糖的酶。此外，黃桿菌在滸苔綠潮爆發(fā)時期大量出現(xiàn)。Liu等分析并比較了膠州灣滸苔綠潮爆發(fā)區(qū)域中不同時期滸苔附著微生物及海水中微生物的結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)滸苔綠潮中期的海水中黃桿菌的豐度最高，達45%。另據(jù)Lin等研究發(fā)現(xiàn)，爆發(fā)滸苔的養(yǎng)殖水體中黃桿菌豐度是沒有爆發(fā)滸苔的水體中的3～5倍。黃桿菌的大量出現(xiàn)可能是由于黃桿菌能首先分解利用滸苔多糖，因而在與其他微生物競爭碳源時占據(jù)優(yōu)勢，得以大量生長繁殖。
本研究對滸苔綠潮期間的微生物進行了分離及鑒定，篩選出了能降解滸苔多糖的微生物，并選取2株代表菌進行了多糖底物利用譜分析。以期能篩選出高效降解滸苔多糖的微生物，并解析其多糖底物利用譜，為由滸苔引起的海洋污染的治理問題提供理論基礎(chǔ)和菌種資源；為工業(yè)上提高滸苔生物量回收利用效率提供新思路。
1材料與方法
1.1滸苔及微生物樣品的采集及分離鑒定
在廣西北海金海灣紅樹林海域和山東青島棧橋及金沙灘海域的滸苔綠潮爆發(fā)地用無菌自封袋和采樣瓶分別采集滸苔及海水樣品。分別分離滸苔附著微生物和海水中的浮游微生物。
滸苔附著微生物的分離方法：取50 g新鮮滸苔用500 mL無菌海水清洗3遍后瀝干，裝入1 000 mL無菌錐形瓶中，加入500 mL無菌海水，置于超聲清洗機中超聲水?。?5 kHz）并用振蕩的方法分離，收集液體。
分別取海水及滸苔附著菌液，梯度稀釋后均勻涂布于2216E固體海洋培養(yǎng)基平板上，倒置放入28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，觀察菌落生長情況。挑取單菌落，接種于2216E液體培養(yǎng)基中，放入28℃恒溫搖床培養(yǎng)24 h。用16S rRNA通用引物對27F/1492R PCR擴增后送測序公司測序，通過比對NCBI數(shù)據(jù)庫，鑒定微生物的種類，并將分離鑒定后的菌株用20%甘油保存于-80℃冰箱中。
選取重點分析的5個菌株，分別根據(jù)NCBI中序列的比對結(jié)果，選取相似度高的幾株菌的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在Mega X中用Clustal W對序列進行比對后用鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
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