瑞香狼毒葉（斷腸草）對(duì)金黃色葡萄球菌和石膏樣毛癬菌生長(zhǎng)曲線的影響——材料與方法
目的研究瑞香狼毒葉提取物對(duì)常見皮膚表面菌的抑菌活性。方法采用藥敏紙片法和二倍稀釋法測(cè)定瑞香狼毒葉提取物對(duì)石膏樣毛癬菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用。結(jié)果瑞香狼毒葉95%乙醇提取物濃度為100 mg·mL-1時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑達(dá)12.8 mm，對(duì)石膏樣毛癬菌抑菌圈直徑達(dá)12.0 mm，二氯甲烷萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌最低抑制濃度(MIC)為0.25mg·mL-1，對(duì)石膏樣毛癬菌MIC為0.50mg·mL-1。結(jié)論瑞香狼毒葉提取物對(duì)石膏樣毛癬菌和金黃色葡萄球菌均有抑制活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌抑制活性較強(qiáng)。
狼毒是一種不常用的中藥，其味苦辛、性平、有毒，瑞香狼毒是狼毒的正名，為瑞香科狼毒屬植物瑞香狼毒的干燥根，又名斷腸草。歷代本草中狼毒是以瑞香科植物瑞香狼毒根收載入藥，具有清熱解毒、消腫、瀉炎癥、止?jié)?、祛腐生肌功能。瑞香狼毒根提取物可以治療?shí)體瘤、肺結(jié)核和牛皮癬，據(jù)最新報(bào)道還有抗病毒的作用，尤其是抗人免疫缺陷病毒的作用。而瑞香狼毒地上部分莖和葉的化學(xué)成分以及生物活性還少見研究。人體皮膚表面菌主要由金黃色葡萄球菌和真菌石膏樣毛癬菌為代表，筆者以上述兩種人體皮膚表面菌為研究對(duì)象，對(duì)瑞香狼毒葉提取物進(jìn)行抑菌活性研究，發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒葉可抑制人皮膚表面菌，報(bào)道如下。
1材料與方法
1.1藥材
瑞香狼毒葉采自四川甘孜州的天然草場(chǎng)，將采回的瑞香狼毒葉陰干、粉碎備用(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院侯太平教授鑒定為正品瑞香狼毒);金黃色葡萄球菌、石膏樣毛癬菌(均由四川成都檢驗(yàn)檢疫局提供標(biāo)準(zhǔn)菌株)。將菌株沾取微量的菌苔接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的典型單菌落轉(zhuǎn)種于滅菌的冷卻液體培養(yǎng)基中，利用搖床37℃培養(yǎng)成原液。用滅菌水把原菌液稀釋成濃度10-1、10-2、10-3……。每個(gè)濃度取2mL與培養(yǎng)基30mL混勻倒3個(gè)平板，27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選生長(zhǎng)菌落數(shù)在30～300個(gè)稀釋濃度作為實(shí)驗(yàn)菌液，金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)菌液為10-7，石膏樣毛癬菌實(shí)驗(yàn)菌液為10-4。
1.2儀器
RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠制造);W201B恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司);SHB-3循環(huán)水多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);802型超凈工作臺(tái)(天津醫(yī)療凈化設(shè)備廠);隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);手提式壓力蒸汽消毒器(成都勝利醫(yī)用設(shè)備廠);游標(biāo)卡尺(上海精美量具廠);生物顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠);Ws70-1型紅外線快速干燥器(上海銀屏儀器儀表有限公司)。
1.3瑞香狼毒樣品提取
稱取適量瑞香狼毒葉粉，用95%乙醇、無(wú)水乙醇回流提取，每種溶劑提取3次，合并3次提取液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮至膏狀物，得到95%乙醇提取物和無(wú)水乙醇提取物。將上述抑菌活性高的95%乙醇提取物，利用石油醚、二氯甲烷、丙酮、甲醇進(jìn)行依次萃取。萃取在分液漏斗中進(jìn)行，萃取溶劑用量按照少量多次進(jìn)行。每次萃取完畢將萃取液分離出來(lái)，再將剩下的進(jìn)行第二次萃取，以此類推，將多次萃取液合并濃縮至膏狀物。分別得到石油醚提取物、二氯甲烷提取物、丙酮提取物、甲醇提取物。
1.4乙醇粗提物的抑菌活性(藥敏紙片法)
將溶解均勻的提取物用純化水稀釋為100，40，16，6.4 mg·m L-14個(gè)濃度，以不加藥而加入樣品溶解劑的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。將濃度為10-7金黃色葡萄球菌菌液接種在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，濃度為10-4石膏樣毛癬菌菌液接種在沙氏平板上。將滅菌冷卻好的直徑為6 mm圓紙片在稀釋好的提取樣品中浸泡透后取出，酒精燈上微烘后，依次貼于平板的位置3個(gè)，同時(shí)貼上空白對(duì)照。將貼好紙片的培養(yǎng)皿輕放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)24 h，真菌27℃培養(yǎng)5 d，然后利用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。每個(gè)樣品濃度平行做3次取平均值。
1.5萃取物的抑菌活性
最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定:將滅菌好的裝有培養(yǎng)液試管排列在試管架上，第一管的裝量6 mL、其余都為3 mL。加入藥液并稀釋:于第一支試管加入原藥液1 g，混勻后吸取3.0 mL加入第二管中，同法依次稀釋試管，最后一管棄去3.0 mL，使之成為遞減系列濃度。并同時(shí)設(shè)對(duì)照組。趁熱將試管放斜面，待培養(yǎng)液凝固后接入菌液0.1 mL，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，石膏樣毛癬菌27℃培養(yǎng)5 d后觀察結(jié)果。從無(wú)菌生長(zhǎng)的各管中找出最低藥物濃度的試管，該管的藥物濃度，即MIC。最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)測(cè)定:待測(cè)定完MIC后，用接種環(huán)挑取無(wú)菌生長(zhǎng)的試管上的培養(yǎng)物移種至不含樣品的斜面上，培養(yǎng)1～3 d后觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)，未見菌落生長(zhǎng)的試管所對(duì)應(yīng)的濃度即為最低殺菌濃度。
1.6二氯甲烷樣品對(duì)兩種菌處理后鏡檢
將樣品制成濃度為2.5 mg·m L-1(10倍MIC)含藥平板，待平板在無(wú)菌室冷卻后取直徑為6 mm的石膏樣毛癬菌菌碟倒貼在藥平板上，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，27℃培養(yǎng)5 d后400倍顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)變化。將樣品稀釋成濃度為2.5 mg·m L-1(10倍MIC)的含藥培養(yǎng)液，取10-7金黃色葡萄球菌菌液接種于含藥培養(yǎng)液中，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，37℃水浴振蕩培養(yǎng)24 h，取菌液0.01 mL滴加在平板上，37℃培養(yǎng)24 h，挑取平板上的菌落在400倍顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)變化。
1.7二氯甲烷樣品對(duì)真菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線的影響
細(xì)菌:將樣品稀釋成濃度為2.5 mg·mL-1(10倍MIC)的含藥培養(yǎng)液，接種金黃色葡萄球菌后在搖床上培養(yǎng)，設(shè)不加藥為對(duì)照。分別于2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 h取菌液，稀釋為10-7，取10-7菌液0.01 mL滴加在平板上，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。真菌:將樣品稀釋成濃度為2.5 mg·m L-1(10倍MIC)的含藥平板，設(shè)不加藥為對(duì)照。培養(yǎng)液平面上均勻放入新生長(zhǎng)一致的三個(gè)石膏樣毛癬菌的菌餅(直徑6 mm)，將菌餅帶菌絲的一面倒貼培養(yǎng)液表面，然后放入27℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10天定時(shí)測(cè)定平板上菌落的直徑增長(zhǎng)，用十字交叉法測(cè)每個(gè)菌落的兩個(gè)直徑，以其平均值代表菌落的直徑。
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